[交流] 载体连接pcr片段一直连不上

3楼: Originally posted by 蓝绿精灵 at 2011-09-25 21:05:35:
谢谢了  我说说最近的两次实验情况吧，之前是转化（无论是热转还是电转）后平板上都未有菌落生长。经重新酶切质粒然后回收，重新找引物合成公司合成引物重新pcr扩增后酶切回收，前一次对照组（pLSB2）和实验组平板 ...

6楼: Originally posted by lsp1018 at 2011-09-26 16:35:27:
提供楼主两种方法：
1.可以换一株相近的宿主菌试试，如果新换的宿主菌中有阳性克隆，只能再换个质粒做载体转入到你的目的菌中。
2.PCR产物直接酶切，有时候可靠性不高。上次实验中也出现与楼主相似情况，长出来 ...

4楼: Originally posted by 清风寨 at 2011-09-26 09:07:34:
首先连接时目的片段和酶切后质粒的摩尔量最好是1：1左右（可通过回收后跑胶 观看亮度大致判断一下 ） 转化时将连接产物加入感受态后30min不要动它 热激90s后放置冰上2min使其冷却 这些都是必须的步骤且不能有错 涂 ...

9楼: Originally posted by 蓝绿精灵 at 2011-09-27 09:15:37:
谢谢  我要连接的两个PCR片段一个是2.7kb,一个是7.8kb。之前我将7.8kb pcr片段连T载体，可一直都连不上，考虑到该片段是不是太大了，所以就放弃做ta克隆了

11楼: Originally posted by lsp1018 at 2011-09-27 13:42:41:
TA克隆的效率非常高，如果说TA克隆连不上，通过酶切连接成功的可能性更低。
顺便请教一下7.8kb的片断是通过哪种DNA聚合酶克隆的？

13楼: Originally posted by 蓝绿精灵 at 2011-09-28 10:50:34:
宝生物 la taq 聚合酶

1899248楼: Originally posted by 蓝绿精灵 at 2011-09-27 09:15:37
谢谢  我要连接的两个PCR片段一个是2.7kb,一个是7.8kb。之前我将7.8kb pcr片段连T载体，可一直都连不上，考虑到该片段是不是太大了，所以就放弃做ta克隆了...

1899988楼: Originally posted by 蓝绿精灵 at 2011-09-27 09:27:48
我要连接的一个pcr片段有7.8kb,是不是做电转化效率要高一些...

17楼: Originally posted by 迷糊虫 at 2016-01-26 13:57:24
同遇到这种问题，双酶切都能切开，但是做连接就连不上，连个假阳性的都没有，困扰好久了，求问LZ这个问题最后是怎么解决得啊？