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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 载体连接pcr片段一直连不上
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蓝绿精灵

铜虫 (初入文坛)

[交流] 载体连接pcr片段一直连不上

我用nde1和xba1双酶切后的载体片段pLSB2（约4.5kb）分别与两个pcr片段做连接，然后做转化，整个实验全部都重新做了一遍，可一直连不上。请那位达人指点一下 ,衷心地表示谢谢！
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分子生物学实验问题

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1楼 2011-09-25 10:50:08
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清风寨

银虫 (小有名气)
★ ★
lstt09nk(金币+2): 鼓励交流 2011-09-25 12:41:10
是你转化后涂布的板子没有长呢 还是挑出来的单菌落没有目的基因呢  你用的什么方法鉴定阳性克隆的  PCR 还是直接抽质粒鉴定 可能原因很多 具体情况说出来可以帮你想想
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2楼2011-09-25 11:13:42
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蓝绿精灵

铜虫 (初入文坛)
谢谢了  我说说最近的两次实验情况吧，之前是转化（无论是热转还是电转）后平板上都未有菌落生长。经重新酶切质粒然后回收，重新找引物合成公司合成引物重新pcr扩增后酶切回收，前一次对照组（pLSB2）和实验组平板上都有菌落生长，实验组经划线培养，然后液体培养提质粒未发现有质粒，确定为假阳性。这一次一个实验组（连的2.6kb pcr片段）平板上有菌落生长，只是不多（几个的样子），经划线培养，然后液体培养提质粒单酶切鉴定，发现多切除一条带来，不知道是否有阳性转化子存在。
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3楼2011-09-25 21:05:35
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清风寨

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
adslye(金币+2): 鼓励交流~祝顺利！ 2011-09-26 09:16:46
蓝绿精灵(金币+5): 非常感谢你即使的建议，我再试试 2011-09-27 09:29:21
首先连接时目的片段和酶切后质粒的摩尔量最好是1：1左右（可通过回收后跑胶 观看亮度大致判断一下 ） 转化时将连接产物加入感受态后30min不要动它 热激90s后放置冰上2min使其冷却 这些都是必须的步骤且不能有错 涂布板子时像你这种基本不长的 可以不进行涂布 直接将恢复1h后的菌液到于平板上晃匀 然后在超净台中开盖吹干 再进行培养 还有就是你可以选用转化效率高的超级感受态 你在鉴定时也不推荐你先抽质粒鉴定 可以做菌落PCR鉴定挑出阳性克隆再挑
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4楼2011-09-26 09:07:34
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tianhuijuan

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by 蓝绿精灵 at 2011-09-25 21:05:35:
谢谢了  我说说最近的两次实验情况吧，之前是转化（无论是热转还是电转）后平板上都未有菌落生长。经重新酶切质粒然后回收，重新找引物合成公司合成引物重新pcr扩增后酶切回收，前一次对照组（pLSB2）和实验组平板 ...

楼上的意思是引物出问题的可能性也很大？偶最近也是做这部分好长时间了，长不出菌落。。
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5楼2011-09-26 16:15:54
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lsp1018

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
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lstt09nk(金币+3): 鼓励交流，欢迎常来 2011-09-27 16:41:59
提供楼主两种方法：
1.可以换一株相近的宿主菌试试，如果新换的宿主菌中有阳性克隆，只能再换个质粒做载体转入到你的目的菌中。
2.PCR产物直接酶切，有时候可靠性不高。上次实验中也出现与楼主相似情况，长出来的全是假阳性。将PCR产物通过ta克隆连接到T载后，挑阳性克隆，胶回收酶切片段后，再与目的质粒连接就解决问题了。

祝好运！
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6楼2011-09-26 16:35:27
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muyanshuang

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
应该是菌株有污染，尽快更换感受态！
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7楼2011-09-26 16:38:29
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fearlessman

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
从头检查一遍实验，包括酶切位点什么的，片段比较大的就是比较难连，建议转化时加点质粒对照，我的经验是转化不行就适当增大载体量，连接不行就增加片段量
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8楼2011-09-26 20:31:04
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蓝绿精灵

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by lsp1018 at 2011-09-26 16:35:27:
提供楼主两种方法：
1.可以换一株相近的宿主菌试试，如果新换的宿主菌中有阳性克隆，只能再换个质粒做载体转入到你的目的菌中。
2.PCR产物直接酶切，有时候可靠性不高。上次实验中也出现与楼主相似情况，长出来 ...

谢谢  我要连接的两个PCR片段一个是2.7kb,一个是7.8kb。之前我将7.8kb pcr片段连T载体，可一直都连不上，考虑到该片段是不是太大了，所以就放弃做ta克隆了
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9楼2011-09-27 09:15:37
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蓝绿精灵

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 清风寨 at 2011-09-26 09:07:34:
首先连接时目的片段和酶切后质粒的摩尔量最好是1：1左右（可通过回收后跑胶 观看亮度大致判断一下 ） 转化时将连接产物加入感受态后30min不要动它 热激90s后放置冰上2min使其冷却 这些都是必须的步骤且不能有错 涂 ...

我要连接的一个pcr片段有7.8kb,是不是做电转化效率要高一些
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10楼2011-09-27 09:27:48
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lsp1018

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
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adslye(金币+2): 感谢交流~~ 2011-09-28 11:28:19
引用回帖:
9楼: Originally posted by 蓝绿精灵 at 2011-09-27 09:15:37:
谢谢  我要连接的两个PCR片段一个是2.7kb,一个是7.8kb。之前我将7.8kb pcr片段连T载体，可一直都连不上，考虑到该片段是不是太大了，所以就放弃做ta克隆了

TA克隆的效率非常高，如果说TA克隆连不上，通过酶切连接成功的可能性更低。
顺便请教一下7.8kb的片断是通过哪种DNA聚合酶克隆的？
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11楼2011-09-27 13:42:41
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tian1203

银虫 (著名写手)
★
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个人观点：2.0kb以上的片段不要用自己做的感受态，DH5也不好用。买JM109试试
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12楼2011-09-27 18:18:23
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蓝绿精灵

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
11楼: Originally posted by lsp1018 at 2011-09-27 13:42:41:
TA克隆的效率非常高，如果说TA克隆连不上，通过酶切连接成功的可能性更低。
顺便请教一下7.8kb的片断是通过哪种DNA聚合酶克隆的？

宝生物 la taq 聚合酶
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13楼2011-09-28 10:50:34
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lsp1018

木虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 蓝绿精灵 at 2011-09-28 10:50:34:
宝生物 la taq 聚合酶

奥，谢谢
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14楼2011-09-28 18:28:50
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sarah-miao

银虫 (正式写手)
★
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引用回帖:
1899248楼: Originally posted by 蓝绿精灵 at 2011-09-27 09:15:37
谢谢  我要连接的两个PCR片段一个是2.7kb,一个是7.8kb。之前我将7.8kb pcr片段连T载体，可一直都连不上，考虑到该片段是不是太大了，所以就放弃做ta克隆了...

其实7.8的连T载体貌似应该好连一些。。。
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15楼2012-11-28 15:17:57
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sarah-miao

银虫 (正式写手)
引用回帖:
1899988楼: Originally posted by 蓝绿精灵 at 2011-09-27 09:27:48
我要连接的一个pcr片段有7.8kb,是不是做电转化效率要高一些...

其实我觉得可以换换感受态试试，有的时候并不是你连接产物的问题
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16楼2012-11-28 15:18:39
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迷糊虫

新虫 (初入文坛)
★
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同遇到这种问题，双酶切都能切开，但是做连接就连不上，连个假阳性的都没有，困扰好久了，求问LZ这个问题最后是怎么解决得啊？
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17楼2016-01-26 13:57:24
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lichee313

金虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
17楼: Originally posted by 迷糊虫 at 2016-01-26 13:57:24
同遇到这种问题，双酶切都能切开，但是做连接就连不上，连个假阳性的都没有，困扰好久了，求问LZ这个问题最后是怎么解决得啊？

感受态细胞效价不高的问题，换个好点的感受态
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18楼2018-10-12 14:42:48
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