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为什么连接这么难呢？
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做了很久的连接了，几乎总是失败。无论是用普通的T4酶连接，还是将片段PCR后用专门的PCR产物连接试剂盒连接；无论是用哪个公司的酶连接，总是连接不上，为什么呢？现在严重怀疑是自己的技术问题…… 连接后转化大肠杆菌，阳性对照每次都可以长出来，就是自己的连接样品不长，无论是新配制的抗性平板，还是配制了大约一个月的抗性平板，都不长……所以我怀疑是自己的连接出了问题，不知道猜想对不对？求各位大侠赐教。 难道是连接后需要纯化吗？但是请教了别的实验室的人，都说一般不需要纯化，都是直接转化的呀~涂板时也注意将涂布器凉了再涂的呀，应该不会将细菌高温杀死了啊？也没敢涂的时间太久啊，大概每块板就两三分钟吧，也应该不会导致细菌死亡啊？……哪里的问题呢？ 连接时的操作都需要注意些什么呢？跪求各位指点啊！跪求……  我这只大菜鸟…… -------------------------------------------------------------------------------------------------- 首先PCR后跑电泳检测，全部上样，割胶回收。然后连接。 连接我做了两组（均为TaKaRa产品）： 1、 10xT4连接Buffer 1ul pMD 18 T 载体 1ul T4 DNA 连接酶 1ul 割胶回收PCR产物 7ul 2、 pMD 18 T 载体 1ul 割胶回收PCR产物 4ul Solution 1 5ul 两者均为16摄氏度连接过夜，我还怕温度不准，放在了PCR仪里，取出来时看了时间，14个小时多，按理说肯定该连接好了。但是转化大肠杆菌后不长。 PCR我也是重新做的，就是想着用新鲜的PCR产物，载体是问别人借的，因为实验室正好用完了，但是别人每次都可以连接成功的……所以我就搞不懂是哪里的问题了，难道是我的酶有问题？ [ Last edited by 西瓜 on 2011-6-8 at 16:05 ] |
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wuzuobin125
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42楼2011-06-12 11:32:03
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2楼2011-06-07 23:20:46
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3楼2011-06-08 08:26:47
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beautybanana
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【答案】应助回帖
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dhd997(金币+5, EPI+1): good 2011-06-08 10:17:25
dhd997(金币+5, EPI+1): good 2011-06-08 10:17:25
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pMD18-T vector ligation system pMD18-T 1uL DNA template 4uL Solution I 5uL Total 10uL 将纯化的PCR产物与T载体连接重组，16℃保温3～4h后，全量（10uL）转化至150uL的E.coli DH5α的感受态细胞。 (1) 将10μL连接液移入含200μL感受态细胞的1.5mL dorf管中，冰浴30-60min。 (2) 42℃水浴热激90sec后，立即再冰浴5min。 (3) 加入300μL LB液体培养基，37℃ 220 rpm培养1-2h。 (4) 吸100μL菌液涂布含Amp/ X-Gal/ IPTG平板培养基的LB固体培养基平板， 37℃ 培养16－24h。 保证PCR产物或感受态细胞的质量即可。 这个我怀疑是感受态细胞的质量或是转化步骤存在很大问题~ |
5楼2011-06-08 08:44:46
poog502
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飘在海上的雪
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9楼2011-06-08 10:35:57
【答案】应助回帖
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西瓜(金币+3): 鼓励交流 2011-06-08 18:54:57
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pMD19-T vector ligation system pMD19-T 1uL DNA 7uL T4DNA连接酶 0.5uL 缓冲液 1uL DD水 1uL 将纯化的PCR产物与T载体连接重组，16℃过夜，全量（10uL）转化至80uL的E.coli DH5α的感受态细胞。 (1) 将10μL连接液移入含80μL感受态细胞的1.5mL Ep管中，冰浴30-60min。 (2) 42℃水浴热激90sec后，立即再冰浴5min。 (3) 加入300μL LB液体培养基，37℃ 220 rpm培养1h。 (4) 吸100μL菌液涂布含Amp平板培养基的LB固体培养基平板， 37℃ 培养8-10h |
10楼2011-06-08 10:41:57