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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 为什么连接这么难呢？
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南海所老龚

新虫 (正式写手)
引用回帖:
43楼: Originally posted by 菜菜的夏子 at 2011-06-12 15:08:25
嗯嗯，我就是来报喜加感谢各位的~我的实验昨天已经做出来了，是我用的连接酶失活了。郁闷的是，我换了实验室好几种连接酶，竟然全部失活了，后来实验成功后恍惚记得好像有一次停电冰箱化了……直到重新买了一管新的 ...

LZ，为什么每次阳性对照都长出来了呢？如果是连接酶失活的话那应该也长不出来的呀。祝好！
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TheBestandMostBeautifulThingsintheWorldCan'tBeSeenorTouched,TheyMustBeFeltwithHeart.
51楼2013-12-11 21:51:15
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随风飘摇11

木虫 (著名写手)
不知道楼主胶回收完之后有没有电泳看一下回收效率怎样？一般纯度不够我们都会再浓缩一下然后再进行连接

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天道酬勤
52楼2013-12-12 10:43:35
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博克侬浮码

银虫 (小有名气)
是不是加的氨苄浓度太大了
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53楼2014-07-23 17:05:38
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随风飘摇11

木虫 (著名写手)
转化的转速是不是有点高，我们感受态转化一般用180转，不过感觉影响不至于那么大，因为你阳性对照没问题，证明转化是没有问题的。另外不一定是你连接的问题，注意一下酶连前酶切这一步，按说切的好的话（都切出粘性末端来）随便一个酶连比例都是能连上的，所以确保酶切没有问题。

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天道酬勤
54楼2014-07-23 23:28:47
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hanjj2011

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 西瓜 at 2011-06-07 23:20:46
阳性对照ok的话，那连接出问题的可能比较大啦。建议你把连接步骤详细说下。
我们实验室的话，如果连接屡次不成，会直接重新做连接底物，PCR重做，载体也重新切。PCR产物用试剂盒纯化，载体酶切之后胶回收纯化，不过 ...

载体酶切之后都要纯化吗 ？ 割胶回收纯化会不会破坏酶切好的末端序列呀，  还有乙醇沉淀纯化具体怎么操作 。我现在也在做链接3000bp的目的片段酶切位点KpnI-EcoRV（平头末端） 链接到载体pCDNA3 上， 做了好久了 都没有链接上，  每次长菌特别多但是都是假阳性，所以想问问我应该怎样改进一下
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55楼2015-10-25 14:50:32
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