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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 为什么连接这么难呢？
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太极拳

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 欢迎交流经验 2011-06-08 18:58:01
我也曾经出现过此问题，后来用的Transgene的PEasy-T1载体，是一种混合液，如果是20次的载体，只需分装成20支PCR小管里，每支管中加入连接产物4ul即可，如果连接产物浓度高可以少加，用ddH2O补加到4ul。连接温度25℃（PCR仪中进行），1K以下5min，1K-2K连接10min，2K以上15-20min即可。载体上有双抗性amp和kan，可先用一种抗性平板涂板，之后挑斑到另一抗性液体培养基中摇菌，基本全是阳性。蓝白斑可做可不做。成功率达到90%以上。希望对楼主有用。
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11楼2011-06-08 12:12:26
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菜菜的夏子

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-06-07 23:20:46:
阳性对照ok的话，那连接出问题的可能比较大啦。建议你把连接步骤详细说下。
我们实验室的话，如果连接屡次不成，会直接重新做连接底物，PCR重做，载体也重新切。PCR产物用试剂盒纯化，载体酶切之后胶回收纯化，不 ...

首先PCR后跑电泳检测，全部上样，割胶回收。然后连接。
连接我做了两组（均为TaKaRa产品）：
1、 10xT4连接Buffer       1ul
      pMD 18 T 载体      1ul
      T4 DNA 连接酶      1ul
      割胶回收PCR产物    7ul

2、 pMD 18 T 载体       1ul
      割胶回收PCR产物     4ul
      Solution 1                 5ul

两者均为16摄氏度连接过夜，我还怕温度不准，放在了PCR仪里，取出来时看了时间，14个小时多，按理说肯定该连接好了。但是转化大肠杆菌后不长。

PCR我也是重新做的，就是想着用新鲜的PCR产物，载体是问别人借的，因为实验室正好用完了，但是别人每次都可以连接成功的……所以我就搞不懂是哪里的问题了，难道是我的酶有问题？
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12楼2011-06-08 14:38:43
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菜菜的夏子

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by healerly at 2011-06-08 08:26:47:
连接按照试剂盒做的话一般都没问题~~最近用Takara的试剂盒做连接，效果总算好点了，我做的时候也是连接处问题，原因可能是水浴锅连的吧~~水浴锅要控制在16度需要加冰·~我本人感觉这样就不准了~~所以最后还是果断 ...

我就是用的Takara的试剂盒做的连接，也是怕温度不准，放在了PCR仪里16度反应过夜了，可还是没成功。
电泳我倒是没有跑，这个我再试试。
PCR产物我也纯化了，还害怕有别的因素影响，我全部上样后割胶回收纯化的，感觉应该还好呀！说到这里我想起来割胶回收后忘了跑电泳看看了，或者是割胶回收的试剂盒太久了……请问这个有可能吗？
连接我做了两组（均为TaKaRa产品）：
1、 10xT4连接Buffer       1ul
      pMD 18 T 载体      1ul
      T4 DNA 连接酶      1ul
      割胶回收PCR产物    7ul

2、 pMD 18 T 载体       1ul
      割胶回收PCR产物     4ul
      Solution 1                 5ul

两者均为16摄氏度连接过夜，放在PCR仪里，取出来时看了时间，14个小时多，按理说肯定该连接好了。但是转化大肠杆菌后不长。

不知是我的酶失效了，还是割胶回收试剂盒失效了……我去跑个电泳看看，谢谢你的答复
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13楼2011-06-08 14:44:56
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菜菜的夏子

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zj408694018 at 2011-06-08 08:41:23:
用Takara的试剂盒做连接，然后放到PCR仪里面，时间久点
还有就是要是你连续连接超过三次都不行的话最好考虑换酶，PCR和酶切的酶
我的也是连接了好久一直连接不上，但是最近换了PCR的酶之后很顺利，连着连接上两 ...

嗯，我再试试，不行将所有的酶和纯化试剂盒换一遍试试看。
谢谢你的建议
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14楼2011-06-08 14:56:11
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菜菜的夏子

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by beautybanana at 2011-06-08 08:44:46:
pMD18-T vector ligation system
pMD18-T                        1uL
DNA template        4uL
Solution I                        5uL
Total                        10uL
将纯化的PCR产物与T载体连接重 ...

我阳性对照可以长出来的啊！大概涂板后8小时就长出来了，很多菌落。所以我觉得我的感受态细胞是没有问题的。我会怀疑是连接的地方问题大些。
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15楼2011-06-08 14:58:14
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菜菜的夏子

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by poog502 at 2011-06-08 08:49:55:
顺便提一下
pMD18-T vector载体的链接效率很低，如果总是做不出来，可以用promega的T easy载体。

嗯嗯，是啊！我用pMD18-T vector或者pMD19-T vector，做连接总是不成功，我都怀疑自己操作太差了，但是听别人说效果还可以呀！为什么我就做不出来呢？
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16楼2011-06-08 15:00:21
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菜菜的夏子

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 飘在海上的雪 at 2011-06-08 08:58:26:
我一直用takara的PMD19-T，一般没出现过什么问题，在4度连接过夜，如果片段稍长，就多连接一天...

我的片段有700多bp，貌似这样大小的片段还比较好连的呀！不过我是16度连接过夜的，我觉得效果应该也很好的，就是经常做不出来……唉
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17楼2011-06-08 15:01:30
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菜菜的夏子

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by sfb1020 at 2011-06-08 10:05:21:
是不是你回收的目的基因不纯，有杂质会影响连接反应。

我是割胶回收的，我跑上电泳了，看看是不是我的凝胶回收试剂盒出问题了。我想起来我的凝胶回收试剂盒里的Buffer DE-B盖子上全是结晶，不知道会不会影响割胶回收的效率？不过感觉还好，加了DE-A后凝胶很快就融化掉了，大约只要2分钟吧，而且切回来的胶我都没有切碎，整块溶解的，很快就溶解掉了。加进DE-B后也是立刻就变为黄色液体了，所以我一直没怀疑割胶回收试剂盒的问题。
    对了，我的凝胶回收试剂盒是AXYGEN公司的。
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18楼2011-06-08 15:05:46
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菜菜的夏子

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★
西瓜(金币+3): 很认真学习啊，一并鼓励下～ 2011-06-08 18:58:27
引用回帖:
Originally posted by shine372 at 2011-06-08 10:41:57:
pMD19-T vector ligation system
pMD19-T                        1uL
DNA                               7uL
T4DNA连接酶                  0.5uL
缓冲液                            1uL
DD水            ...

我是这样做的。
首先PCR后跑电泳检测，全部上样，割胶回收。然后连接。
连接我做了两组（均为TaKaRa产品）：
1、 10xT4连接Buffer       1ul
      pMD 18 T 载体      1ul
      T4 DNA 连接酶      1ul
      割胶回收PCR产物    7ul

2、 pMD 18 T 载体       1ul
      割胶回收PCR产物     4ul
      Solution 1                 5ul

(1) 16℃过夜（超过12h），全量（10uL）转化至100ul新鲜制备，冰浴放置12h-16h的E.coli DH5α的感受态细胞，冰浴30min。
(2) 37℃水浴热激5min（老师说42度90s或者37度5min都可以，我是觉得5min更好控制）后，立即再冰浴2-3min。
(3) 加入900μL LB液体培养基，37℃ 培养1-2h。
(4) 离心，弃900ul上清，将剩余100μL混匀菌液，涂布含Amp的LB固体培养基平板， 37℃ 培养8-14h 。
阳性对照8小时候就长了，我的样品现在早过了14h，还是一个菌落也没有……
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19楼2011-06-08 15:12:19
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poog502

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励交流.我们一般垫保鲜膜，呵呵～ 2011-06-08 18:59:09
引用回帖:
Originally posted by 菜菜的夏子 at 2011-06-08 15:05:46:
我是割胶回收的，我跑上电泳了，看看是不是我的凝胶回收试剂盒出问题了。我想起来我的凝胶回收试剂盒里的Buffer DE-B盖子上全是结晶，不知道会不会影响割胶回收的效率？不过感觉还好，加了DE-A后凝胶很快就融化 ...

回收后的效率可以点10微升，跑个电泳看看你到底回收起来了没有。爱思进的胶回收试剂盒质量很好的。通常是4度回收连接过夜，只有takara的是16度，但我们一直用的是4度冰箱过夜(>16 h)。胶回收的时候记得在凝胶下面垫一个PE手套，防止其他小片段也被你回收上来了。
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20楼2011-06-08 15:16:26
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