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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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ljp7786

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
菜菜的夏子(金币+2): 谢谢你的几个建议，学习了~ 2011-06-08 21:47:17
西瓜(金币+5, EPI+1): 独家建议，难得噢！ 2011-06-08 22:31:22
首先确定你的PCR产物平末端还是粘末端，如果是平末端，PCR产物跑胶回收后做一个加A反应，再和T载体连。
其次，你的片段多大，1KB以上，我认为需要多连一段时间，最好4度过夜，4度下连接比较稳定，16度连接连接产物不稳定，最好能摸一下片段与载体的比例。
再次：你可以将载体和片段混合后在加入链接酶前在65度热击5min，置冰上速冷2分钟，然后加入酶或solutionI，4度连24小时。转化一般不会出问题。不要在这方面纠结。连接不上主要是片段的问题及其与载体的比例问题。
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31楼2011-06-08 16:37:46
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healerly

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
32楼2011-06-08 16:46:14
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
引用回帖:
Originally posted by 菜菜的夏子 at 2011-06-08 15:22:05:
嗯，我请教了别的实验室的，他们用TaKaRa的连接酶也是在4度连接的，我就是想着TaKaRa的连接酶貌似16度效果更好，就放在了16度。请问TaKaRa的连接酶在4度和16度，哪个效果更好呢？
    顺便想请教下，在下面垫 ...

也可以垫保鲜膜
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33楼2011-06-08 19:01:24
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nuoyaeva

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★ ★
西瓜(金币+3): 欢迎交流。貌似换头像了？但帖子后面两个表情让我认出您了。。。。 2011-06-08 22:33:04
为什么大家给出的反应条件都是体积数，而且也没有给出insert片段和vector的浓度。
而且楼主，你注意你的insert是blunt还是sticky的？和vector匹配吗？
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生活是美好的
34楼2011-06-08 20:18:22
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菜菜的夏子

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by ljp7786 at 2011-06-08 16:37:46:
首先确定你的PCR产物平末端还是粘末端，如果是平末端，PCR产物跑胶回收后做一个加A反应，再和T载体连。
其次，你的片段多大，1KB以上，我认为需要多连一段时间，最好4度过夜，4度下连接比较稳定，16度连接连接产 ...

我的是粘性末端连接。
我的片段有700多bp，这次我试试4度连接，呵呵。
还有你给我的最后一个建议，我一定付诸实践，希望这次可以做出来
谢谢
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35楼2011-06-08 21:43:07
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菜菜的夏子

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by healerly at 2011-06-08 16:46:14:
唉~~我也是纠结了好久~~今天送去测序的结果又有问题了~~~~没测出来~~~加油吧~~共同努力，肯定能做出来的。

嗯。，共同努力
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36楼2011-06-08 21:43:26
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菜菜的夏子

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-06-08 19:01:24:
也可以垫保鲜膜

是滴~
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37楼2011-06-08 21:43:57
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菜菜的夏子

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by nuoyaeva at 2011-06-08 20:18:22:
为什么大家给出的反应条件都是体积数，而且也没有给出insert片段和vector的浓度。
而且楼主，你注意你的insert是blunt还是sticky的？和vector匹配吗？

我的是粘性末端连接。
和vector匹配是什么意思？一般PCR后不是都可以用PCR产物连接试剂盒连接的吗？如果大侠是指我之前的片段和载体连接的话，我还真的不知道匹配不匹配？这个怎么看呢？敬请指教~
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38楼2011-06-08 21:46:19
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nuoyaeva

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 菜菜的夏子 at 2011-06-08 22:46:19:
我的是粘性末端连接。
和vector匹配是什么意思？一般PCR后不是都可以用PCR产物连接试剂盒连接的吗？如果大侠是指我之前的片段和载体连接的话，我还真的不知道匹配不匹配？这个怎么看呢？敬请指教~

PCR的产物也分为平端产物和粘端产物啊，比如你用primeSTAR这类polymerase得到的产物就是平端的，那你就得用blunt-vector，如果你是用r-Taq这类的polymerase，得到的产物就是粘端的，多了一个A，那你就的用粘性的vector，比如什么T easy vector，名字记不太清了...不好意思...
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生活是美好的
39楼2011-06-08 22:04:09
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菜菜的夏子

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by nuoyaeva at 2011-06-08 22:04:09:
PCR的产物也分为平端产物和粘端产物啊，比如你用primeSTAR这类polymerase得到的产物就是平端的，那你就得用blunt-vector，如果你是用r-Taq这类的polymerase，得到的产物就是粘端的，多了一个A，那你就的用粘性 ...

哦，我明白了，谢谢你
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40楼2011-06-09 10:34:48
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