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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 为什么连接这么难呢？
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churchill87426

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by ljp7786 at 2011-06-08 16:37:46:
首先确定你的PCR产物平末端还是粘末端，如果是平末端，PCR产物跑胶回收后做一个加A反应，再和T载体连。
其次，你的片段多大，1KB以上，我认为需要多连一段时间，最好4度过夜，4度下连接比较稳定，16度连接连接产 ...

请问“加入链接酶前在65度热击5min，置冰上速冷2分钟” 是什么原理啊？
我也在TA克隆...也连不上...我的片段2100bp
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41楼2011-06-11 17:51:49
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wuzuobin125

铜虫 (小有名气)
经过这么多童鞋的努力和总结，LZ的问题应该是解决了。生物实验不像做木工，任何时候和环节都能看得到摸得着，如果实验失败了，那就要从实验的开始理清思路，回放实验过程，然后是针对每个环节进行排除，只有这样才能让自己有信心将实验进行下去，而且一旦将问题找到，这将极大增强自己的实验信心。
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42楼2011-06-12 11:32:03
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菜菜的夏子

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by wuzuobin125 at 2011-06-12 11:32:03:
经过这么多童鞋的努力和总结，LZ的问题应该是解决了。生物实验不像做木工，任何时候和环节都能看得到摸得着，如果实验失败了，那就要从实验的开始理清思路，回放实验过程，然后是针对每个环节进行排除，只有这样才 ...

嗯嗯，我就是来报喜加感谢各位的~我的实验昨天已经做出来了，是我用的连接酶失活了。郁闷的是，我换了实验室好几种连接酶，竟然全部失活了，后来实验成功后恍惚记得好像有一次停电冰箱化了……直到重新买了一管新的，才做出来了……唉，浪费了好多时间……
    不过庆幸的是做出来了，TA克隆和我自己的载体片段连接都成功了，这还得感谢各位给我的意见和建议，小木虫真不错！从昨天开始心情就一直不错，呵呵，谢谢各位啦！以后多多交流呀
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43楼2011-06-12 15:08:25
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
送鲜花一朵
恭喜恭喜
欢迎常来交流啊～
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44楼2011-06-12 18:03:52
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菜菜的夏子

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-06-12 18:03:52:
恭喜恭喜
欢迎常来交流啊～

嗯嗯
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45楼2011-06-12 21:11:10
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daiyuanfeng

新虫 (初入文坛)
大家好，我最近做了一个月16S的测序了，测不出来，总是出现问题。最后把目的片段与T载体链接，转化之后挑单菌落摇菌，但提不出质粒，师兄师姐说是没有连接上，请教各位高手
我的流程是：1、纯化PCR产物，然后与T载体连接，置于16摄氏度过夜连接（我也连接过3-4h）  体系：
pMD19-T                        0.5uL
DNA                              4.5uL
Solution 1                5uL
2、全量（10uL）转化至100uL的E.coli DH5α的感受态细胞。
(1) 将10μL连接液移入含100μL感受态细胞的1.5mL Ep管中，冰浴30min。
(2) 42℃水浴热激0-690sec后，立即再冰浴2-3min。
(3) 加入900μL LB液体培养基，37℃ 150 rpm培养1h。
(4) 吸100μL菌液涂布含X-gal100和Amp100平板培养基的LB固体培养基平板， 37℃ 培养8-14h
最后全是白斑，一个蓝斑都没有，挑单菌落划线，用16S的引物PCR验证，然后摇菌，菌液很浓，就是提不出质粒，这是为什么呢？
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46楼2012-03-28 16:47:50
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动力泉

金虫 (正式写手)
会不会是切胶回收的时间太长导致PCR产物形成二聚体，建议重新回收产物
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好好学习
47楼2012-05-21 13:31:28
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聂子3388

铜虫 (小有名气)
你可以不用在PCR仪上酶连，在保温盒里酶连过夜。我之前在PCR仪上酶连也没转化成功，但是在保温盒里就成功了
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48楼2013-07-15 15:57:34
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hyphen007

金虫 (小有名气)
同意3楼，还有，你的目的片段多大？
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49楼2013-07-15 19:49:02
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匿名

用户注销 (初入文坛)
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50楼2013-07-16 11:34:00
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