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菜菜的夏子

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 太极拳 at 2011-06-08 12:12:26:
我也曾经出现过此问题,后来用的Transgene的PEasy-T1载体,是一种混合液,如果是20次的载体,只需分装成20支PCR小管里,每支管中加入连接产物4ul即可,如果连接产物浓度高可以少加,用ddH2O补加到4ul。连接温度25 ...

谢谢你的建议。
    其实刚开始我是要把片段连进我双酶切后的载体的(片段PCR后也双酶切,引物两边已经设计了双酶切的保护碱基),但是一直不成功,所以现在改为先将片段PCR,先用PCR产物连接试剂盒试试看,看是不是其他的问题,但是PCR后用试剂盒连接竟然也没有成功……
    我的最终目的还是希望连进我自己的载体里面的。不知道该怎么办了,唉~
21楼2011-06-08 15:16:59
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菜菜的夏子

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by poog502 at 2011-06-08 15:16:26:
回收后的效率可以点10微升,跑个电泳看看你到底回收起来了没有。爱思进的胶回收试剂盒质量很好的。通常是4度回收连接过夜,只有takara的是16度,但我们一直用的是4度冰箱过夜(>16 h)。胶回收的时候记得在凝 ...

嗯,我请教了别的实验室的,他们用TaKaRa的连接酶也是在4度连接的,我就是想着TaKaRa的连接酶貌似16度效果更好,就放在了16度。请问TaKaRa的连接酶在4度和16度,哪个效果更好呢?
    顺便想请教下,在下面垫一个PE手套,如何就能防止其他的小片段被回收上来?我没看懂,真不好意思……
22楼2011-06-08 15:22:05
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Eva2009

禁虫 (初入文坛)

★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4): 欢迎新虫交流 2011-06-08 19:00:06
本帖内容被屏蔽

23楼2011-06-08 15:31:03
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shuifen1108

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励交流 2011-06-08 19:00:14
应该不是涂板子的问题,建议楼主从PCR引物开始检查吧,连接反应还是比较容易做的吧,温度16摄氏度以下基本都是可以的,还有就是载体和PCR产物的比例关系。祝LZ实验顺利
24楼2011-06-08 15:36:00
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菜菜的夏子

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by Eva2009 at 2011-06-08 15:31:03:
可以把片段先导入到PMD-18T simple  vector上(自己在引物上加上酶切位点),这个重组率是很高的,然后再把含片段的重组载体酶切,与载体连接

嗯嗯,谢谢你的建议
    我本来用PMD-18T  vector就想着就算连进去我酶切时也是个麻烦,因为我的片段一段的一个酶切位点跟载体的重复了,没注意到还有PMD-18T simple  vector,真是太谢谢了!呵呵。
   去跟老板商量一下是否可以买一点儿,嘿嘿。
25楼2011-06-08 15:38:32
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菜菜的夏子

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by shuifen1108 at 2011-06-08 15:36:00:
应该不是涂板子的问题,建议楼主从PCR引物开始检查吧,连接反应还是比较容易做的吧,温度16摄氏度以下基本都是可以的,还有就是载体和PCR产物的比例关系。祝LZ实验顺利

嗯,谢谢。我重新开始一步步检查。割胶回收产物跑电泳了,我取了5ul跑电泳的,有条带的,单一,亮度一般,主要是我的凝胶也放了好几天了,可能EB也有一些挥发,总之是有条带的。应该凝胶回收试剂盒问题也不大。
    谢谢你的建议
26楼2011-06-08 15:42:00
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shuifen1108

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by 菜菜的夏子 at 2011-06-08 15:42:00:
嗯,谢谢。我重新开始一步步检查。割胶回收产物跑电泳了,我取了5ul跑电泳的,有条带的,单一,亮度一般,主要是我的凝胶也放了好几天了,可能EB也有一些挥发,总之是有条带的。应该凝胶回收试剂盒问题也不大。 ...

呵呵 不用谢  生物实验就是这样麻烦  最后结果出问题  与其一步步的找原因  不如重新做一遍来的快  当然运气好除外  LZ心平气和的做实验啊 祝福
27楼2011-06-08 15:53:26
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poog502

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by 菜菜的夏子 at 2011-06-08 15:22:05:
嗯,我请教了别的实验室的,他们用TaKaRa的连接酶也是在4度连接的,我就是想着TaKaRa的连接酶貌似16度效果更好,就放在了16度。请问TaKaRa的连接酶在4度和16度,哪个效果更好呢?
    顺便想请教下,在下面垫 ...

垫个PE手套防止你把别人电泳跑出来的小片段回收了
28楼2011-06-08 16:10:27
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菜菜的夏子

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by shuifen1108 at 2011-06-08 15:53:26:
呵呵 不用谢  生物实验就是这样麻烦  最后结果出问题  与其一步步的找原因  不如重新做一遍来的快  当然运气好除外  LZ心平气和的做实验啊 祝福

29楼2011-06-08 16:24:49
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菜菜的夏子

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by poog502 at 2011-06-08 16:10:27:
垫个PE手套防止你把别人电泳跑出来的小片段回收了

哦,我明白了,谢谢
30楼2011-06-08 16:25:04
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