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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 为什么连接这么难呢？
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菜菜的夏子

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 太极拳 at 2011-06-08 12:12:26:
我也曾经出现过此问题，后来用的Transgene的PEasy-T1载体，是一种混合液，如果是20次的载体，只需分装成20支PCR小管里，每支管中加入连接产物4ul即可，如果连接产物浓度高可以少加，用ddH2O补加到4ul。连接温度25 ...

谢谢你的建议。
    其实刚开始我是要把片段连进我双酶切后的载体的（片段PCR后也双酶切，引物两边已经设计了双酶切的保护碱基），但是一直不成功，所以现在改为先将片段PCR，先用PCR产物连接试剂盒试试看，看是不是其他的问题，但是PCR后用试剂盒连接竟然也没有成功……
    我的最终目的还是希望连进我自己的载体里面的。不知道该怎么办了，唉~
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21楼2011-06-08 15:16:59
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菜菜的夏子

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by poog502 at 2011-06-08 15:16:26:
回收后的效率可以点10微升，跑个电泳看看你到底回收起来了没有。爱思进的胶回收试剂盒质量很好的。通常是4度回收连接过夜，只有takara的是16度，但我们一直用的是4度冰箱过夜(>16 h)。胶回收的时候记得在凝 ...

嗯，我请教了别的实验室的，他们用TaKaRa的连接酶也是在4度连接的，我就是想着TaKaRa的连接酶貌似16度效果更好，就放在了16度。请问TaKaRa的连接酶在4度和16度，哪个效果更好呢？
    顺便想请教下，在下面垫一个PE手套，如何就能防止其他的小片段被回收上来？我没看懂，真不好意思……
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22楼2011-06-08 15:22:05
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Eva2009

禁虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4): 欢迎新虫交流 2011-06-08 19:00:06
本帖内容被屏蔽
23楼2011-06-08 15:31:03
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shuifen1108

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励交流 2011-06-08 19:00:14
应该不是涂板子的问题，建议楼主从ＰＣＲ引物开始检查吧，连接反应还是比较容易做的吧，温度１６摄氏度以下基本都是可以的，还有就是载体和ＰＣＲ产物的比例关系。祝LZ实验顺利
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24楼2011-06-08 15:36:00
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菜菜的夏子

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by Eva2009 at 2011-06-08 15:31:03:
可以把片段先导入到PMD-18T simple  vector上（自己在引物上加上酶切位点），这个重组率是很高的，然后再把含片段的重组载体酶切，与载体连接

嗯嗯，谢谢你的建议
    我本来用PMD-18T  vector就想着就算连进去我酶切时也是个麻烦，因为我的片段一段的一个酶切位点跟载体的重复了，没注意到还有PMD-18T simple  vector，真是太谢谢了！呵呵。
   去跟老板商量一下是否可以买一点儿，嘿嘿。
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25楼2011-06-08 15:38:32
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菜菜的夏子

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by shuifen1108 at 2011-06-08 15:36:00:
应该不是涂板子的问题，建议楼主从ＰＣＲ引物开始检查吧，连接反应还是比较容易做的吧，温度１６摄氏度以下基本都是可以的，还有就是载体和ＰＣＲ产物的比例关系。祝LZ实验顺利

嗯，谢谢。我重新开始一步步检查。割胶回收产物跑电泳了，我取了5ul跑电泳的，有条带的，单一，亮度一般，主要是我的凝胶也放了好几天了，可能EB也有一些挥发，总之是有条带的。应该凝胶回收试剂盒问题也不大。
    谢谢你的建议
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26楼2011-06-08 15:42:00
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shuifen1108

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 菜菜的夏子 at 2011-06-08 15:42:00:
嗯，谢谢。我重新开始一步步检查。割胶回收产物跑电泳了，我取了5ul跑电泳的，有条带的，单一，亮度一般，主要是我的凝胶也放了好几天了，可能EB也有一些挥发，总之是有条带的。应该凝胶回收试剂盒问题也不大。 ...

呵呵 不用谢  生物实验就是这样麻烦  最后结果出问题  与其一步步的找原因  不如重新做一遍来的快  当然运气好除外  ＬＺ心平气和的做实验啊　祝福
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27楼2011-06-08 15:53:26
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poog502

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 菜菜的夏子 at 2011-06-08 15:22:05:
嗯，我请教了别的实验室的，他们用TaKaRa的连接酶也是在4度连接的，我就是想着TaKaRa的连接酶貌似16度效果更好，就放在了16度。请问TaKaRa的连接酶在4度和16度，哪个效果更好呢？
    顺便想请教下，在下面垫 ...

垫个PE手套防止你把别人电泳跑出来的小片段回收了
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28楼2011-06-08 16:10:27
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菜菜的夏子

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by shuifen1108 at 2011-06-08 15:53:26:
呵呵 不用谢  生物实验就是这样麻烦  最后结果出问题  与其一步步的找原因  不如重新做一遍来的快  当然运气好除外  ＬＺ心平气和的做实验啊　祝福

嗯
29楼2011-06-08 16:24:49
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菜菜的夏子

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by poog502 at 2011-06-08 16:10:27:
垫个PE手套防止你把别人电泳跑出来的小片段回收了

哦，我明白了，谢谢
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30楼2011-06-08 16:25:04
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