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beautybanana

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): good 2011-06-08 10:17:25
引用回帖:
Originally posted by 菜菜的夏子 at 2011-06-07 22:48:42:
做了很久的连接了,几乎总是失败。无论是用普通的T4酶连接,还是将片段PCR后用专门的PCR产物连接试剂盒连接;无论是用哪个公司的酶连接,总是连接不上,为什么呢?现在严重怀疑是自己的技术问题……
    连接后转 ...

pMD18-T vector ligation system
pMD18-T                        1uL
DNA template        4uL
Solution I                        5uL
Total                        10uL
将纯化的PCR产物与T载体连接重组,16℃保温3~4h后,全量(10uL)转化至150uL的E.coli DH5α的感受态细胞。
(1) 将10μL连接液移入含200μL感受态细胞的1.5mL dorf管中,冰浴30-60min。
(2) 42℃水浴热激90sec后,立即再冰浴5min。
(3) 加入300μL LB液体培养基,37℃ 220 rpm培养1-2h。
(4) 吸100μL菌液涂布含Amp/ X-Gal/ IPTG平板培养基的LB固体培养基平板, 37℃ 培养16-24h。
保证PCR产物或感受态细胞的质量即可。

这个我怀疑是感受态细胞的质量或是转化步骤存在很大问题~
5楼2011-06-08 08:44:46
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智能机器人

Robot (super robot)

我们都爱小木虫

ljp7786

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
菜菜的夏子(金币+2): 谢谢你的几个建议,学习了~ 2011-06-08 21:47:17
西瓜(金币+5, EPI+1): 独家建议,难得噢! 2011-06-08 22:31:22
首先确定你的PCR产物平末端还是粘末端,如果是平末端,PCR产物跑胶回收后做一个加A反应,再和T载体连。
其次,你的片段多大,1KB以上,我认为需要多连一段时间,最好4度过夜,4度下连接比较稳定,16度连接连接产物不稳定,最好能摸一下片段与载体的比例。
再次:你可以将载体和片段混合后在加入链接酶前在65度热击5min,置冰上速冷2分钟,然后加入酶或solutionI,4度连24小时。转化一般不会出问题。不要在这方面纠结。连接不上主要是片段的问题及其与载体的比例问题。
31楼2011-06-08 16:37:46
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