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beautybanana

木虫 (著名写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): good 2011-06-08 10:17:25

引用回帖:

Originally posted by 菜菜的夏子 at 2011-06-07 22:48:42:
做了很久的连接了，几乎总是失败。无论是用普通的T4酶连接，还是将片段PCR后用专门的PCR产物连接试剂盒连接；无论是用哪个公司的酶连接，总是连接不上，为什么呢？现在严重怀疑是自己的技术问题……
连接后转 ...

pMD18-T vector ligation system
pMD18-T                      1uL
DNA template       4uL
Solution I                      5uL
Total                      10uL
将纯化的PCR产物与T载体连接重组，16℃保温3～4h后，全量（10uL）转化至150uL的E.coli DH5α的感受态细胞。
(1) 将10μL连接液移入含200μL感受态细胞的1.5mL dorf管中，冰浴30-60min。
(2) 42℃水浴热激90sec后，立即再冰浴5min。
(3) 加入300μL LB液体培养基，37℃ 220 rpm培养1-2h。
(4) 吸100μL菌液涂布含Amp/ X-Gal/ IPTG平板培养基的LB固体培养基平板， 37℃ 培养16－24h。
保证PCR产物或感受态细胞的质量即可。

这个我怀疑是感受态细胞的质量或是转化步骤存在很大问题~

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5楼2011-06-08 08:44:46

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
菜菜的夏子(金币+2): 谢谢你的几个建议，学习了~ 2011-06-08 21:47:17
西瓜(金币+5, EPI+1): 独家建议，难得噢！ 2011-06-08 22:31:22

首先确定你的PCR产物平末端还是粘末端，如果是平末端，PCR产物跑胶回收后做一个加A反应，再和T载体连。
其次，你的片段多大，1KB以上，我认为需要多连一段时间，最好4度过夜，4度下连接比较稳定，16度连接连接产物不稳定，最好能摸一下片段与载体的比例。
再次：你可以将载体和片段混合后在加入链接酶前在65度热击5min，置冰上速冷2分钟，然后加入酶或solutionI，4度连24小时。转化一般不会出问题。不要在这方面纠结。连接不上主要是片段的问题及其与载体的比例问题。

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31楼2011-06-08 16:37:46

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