| 查看: 4176 | 回复: 54 | ||
| 本帖产生 2 个 MolEPI ，点击这里进行查看 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
[求助]
为什么连接这么难呢？
|
||
|
做了很久的连接了，几乎总是失败。无论是用普通的T4酶连接，还是将片段PCR后用专门的PCR产物连接试剂盒连接；无论是用哪个公司的酶连接，总是连接不上，为什么呢？现在严重怀疑是自己的技术问题…… 连接后转化大肠杆菌，阳性对照每次都可以长出来，就是自己的连接样品不长，无论是新配制的抗性平板，还是配制了大约一个月的抗性平板，都不长……所以我怀疑是自己的连接出了问题，不知道猜想对不对？求各位大侠赐教。 难道是连接后需要纯化吗？但是请教了别的实验室的人，都说一般不需要纯化，都是直接转化的呀~涂板时也注意将涂布器凉了再涂的呀，应该不会将细菌高温杀死了啊？也没敢涂的时间太久啊，大概每块板就两三分钟吧，也应该不会导致细菌死亡啊？……哪里的问题呢？ 连接时的操作都需要注意些什么呢？跪求各位指点啊！跪求……  我这只大菜鸟…… -------------------------------------------------------------------------------------------------- 首先PCR后跑电泳检测，全部上样，割胶回收。然后连接。 连接我做了两组（均为TaKaRa产品）： 1、 10xT4连接Buffer 1ul pMD 18 T 载体 1ul T4 DNA 连接酶 1ul 割胶回收PCR产物 7ul 2、 pMD 18 T 载体 1ul 割胶回收PCR产物 4ul Solution 1 5ul 两者均为16摄氏度连接过夜，我还怕温度不准，放在了PCR仪里，取出来时看了时间，14个小时多，按理说肯定该连接好了。但是转化大肠杆菌后不长。 PCR我也是重新做的，就是想着用新鲜的PCR产物，载体是问别人借的，因为实验室正好用完了，但是别人每次都可以连接成功的……所以我就搞不懂是哪里的问题了，难道是我的酶有问题？ [ Last edited by 西瓜 on 2011-6-8 at 16:05 ] |
回复此楼» 本帖已获得的红花（最新10朵）
西瓜» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有179人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
博克侬浮码
银虫 (小有名气)
- 应助: 7 (幼儿园)
- 金币: 318.5
- 散金: 406
- 帖子: 107
- 在线: 47.4小时
- 虫号: 2814101
- 注册: 2013-11-20
- 专业: 病原微生物变异与耐药
53楼2014-07-23 17:05:38
西瓜
荣誉版主 (知名作家)
- MolEPI: 50
- 应助: 94 (初中生)
- 贵宾: 3.157
- 金币: 1849.6
- 散金: 11458
- 红花: 116
- 沙发: 21
- 帖子: 7553
- 在线: 1449.5小时
- 虫号: 271749
- 注册: 2006-08-13
- 性别: GG
- 专业: 细胞衰老
- 管辖: 分子生物
2楼2011-06-07 23:20:46
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5): good 2011-06-08 10:16:54
dhd997(金币+5): good 2011-06-08 10:16:54
|
本帖内容被屏蔽 |
3楼2011-06-08 08:26:47
4楼2011-06-08 08:41:23
