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菜菜的夏子

铜虫 (小有名气)

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专业: 生物化学

[求助] 为什么连接这么难呢？

做了很久的连接了，几乎总是失败。无论是用普通的T4酶连接，还是将片段PCR后用专门的PCR产物连接试剂盒连接；无论是用哪个公司的酶连接，总是连接不上，为什么呢？现在严重怀疑是自己的技术问题……
连接后转化大肠杆菌，阳性对照每次都可以长出来，就是自己的连接样品不长，无论是新配制的抗性平板，还是配制了大约一个月的抗性平板，都不长……所以我怀疑是自己的连接出了问题，不知道猜想对不对？求各位大侠赐教。
难道是连接后需要纯化吗？但是请教了别的实验室的人，都说一般不需要纯化，都是直接转化的呀~涂板时也注意将涂布器凉了再涂的呀，应该不会将细菌高温杀死了啊？也没敢涂的时间太久啊，大概每块板就两三分钟吧，也应该不会导致细菌死亡啊？……哪里的问题呢？
连接时的操作都需要注意些什么呢？跪求各位指点啊！跪求……

我这只大菜鸟……

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首先PCR后跑电泳检测，全部上样，割胶回收。然后连接。
连接我做了两组（均为TaKaRa产品）：
1、 10xT4连接Buffer    1ul
   pMD 18 T 载体    1ul
   T4 DNA 连接酶    1ul
   割胶回收PCR产物 7ul

2、 pMD 18 T 载体    1ul
   割胶回收PCR产物    4ul
   Solution 1                5ul

两者均为16摄氏度连接过夜，我还怕温度不准，放在了PCR仪里，取出来时看了时间，14个小时多，按理说肯定该连接好了。但是转化大肠杆菌后不长。

PCR我也是重新做的，就是想着用新鲜的PCR产物，载体是问别人借的，因为实验室正好用完了，但是别人每次都可以连接成功的……所以我就搞不懂是哪里的问题了，难道是我的酶有问题？

[ Last edited by 西瓜 on 2011-6-8 at 16:05 ]

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