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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 为什么连接这么难呢？
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菜菜的夏子

铜虫 (小有名气)

[求助] 为什么连接这么难呢？

做了很久的连接了，几乎总是失败。无论是用普通的T4酶连接，还是将片段PCR后用专门的PCR产物连接试剂盒连接；无论是用哪个公司的酶连接，总是连接不上，为什么呢？现在严重怀疑是自己的技术问题……
    连接后转化大肠杆菌，阳性对照每次都可以长出来，就是自己的连接样品不长，无论是新配制的抗性平板，还是配制了大约一个月的抗性平板，都不长……所以我怀疑是自己的连接出了问题，不知道猜想对不对？求各位大侠赐教。
    难道是连接后需要纯化吗？但是请教了别的实验室的人，都说一般不需要纯化，都是直接转化的呀~涂板时也注意将涂布器凉了再涂的呀，应该不会将细菌高温杀死了啊？也没敢涂的时间太久啊，大概每块板就两三分钟吧，也应该不会导致细菌死亡啊？……哪里的问题呢？
    连接时的操作都需要注意些什么呢？跪求各位指点啊！跪求……
       我这只大菜鸟……
--------------------------------------------------------------------------------------------------
首先PCR后跑电泳检测，全部上样，割胶回收。然后连接。
连接我做了两组（均为TaKaRa产品）：
1、 10xT4连接Buffer       1ul
      pMD 18 T 载体      1ul
      T4 DNA 连接酶      1ul
      割胶回收PCR产物    7ul

2、 pMD 18 T 载体       1ul
      割胶回收PCR产物     4ul
      Solution 1                 5ul

两者均为16摄氏度连接过夜，我还怕温度不准，放在了PCR仪里，取出来时看了时间，14个小时多，按理说肯定该连接好了。但是转化大肠杆菌后不长。

PCR我也是重新做的，就是想着用新鲜的PCR产物，载体是问别人借的，因为实验室正好用完了，但是别人每次都可以连接成功的……所以我就搞不懂是哪里的问题了，难道是我的酶有问题？

[ Last edited by 西瓜 on 2011-6-8 at 16:05 ]
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西瓜

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1楼 2011-06-07 22:48:42
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sfb1020

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
dhd997(金币+2): 鼓励 2011-06-08 10:17:58
dhd997(金币+2): 鼓励 2011-06-08 10:18:09
是不是你回收的目的基因不纯，有杂质会影响连接反应。
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8楼2011-06-08 10:05:21
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★ ★ ★
dhd997(金币+3): 2011-06-08 10:16:38
阳性对照ok的话，那连接出问题的可能比较大啦。建议你把连接步骤详细说下。
我们实验室的话，如果连接屡次不成，会直接重新做连接底物，PCR重做，载体也重新切。PCR产物用试剂盒纯化，载体酶切之后胶回收纯化，不过也有人上述两者都只是乙醇沉淀纯化，做得也很好。连接产物我们从来不纯化呢。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2011-06-07 23:20:46
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healerly

禁虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5): good 2011-06-08 10:16:54
本帖内容被屏蔽
3楼2011-06-08 08:26:47
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zj408694018

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-06-08 10:17:06
用Takara的试剂盒做连接，然后放到PCR仪里面，时间久点
还有就是要是你连续连接超过三次都不行的话最好考虑换酶，PCR和酶切的酶
我的也是连接了好久一直连接不上，但是最近换了PCR的酶之后很顺利，连着连接上两个，呵呵
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2011-06-08 08:41:23
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