| 查看: 5083 | 回复: 54 | ||||
| 本帖产生 2 个 MolEPI ，点击这里进行查看 | ||||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||||
[求助]
为什么连接这么难呢？
|
||||
|
做了很久的连接了，几乎总是失败。无论是用普通的T4酶连接，还是将片段PCR后用专门的PCR产物连接试剂盒连接；无论是用哪个公司的酶连接，总是连接不上，为什么呢？现在严重怀疑是自己的技术问题…… 连接后转化大肠杆菌，阳性对照每次都可以长出来，就是自己的连接样品不长，无论是新配制的抗性平板，还是配制了大约一个月的抗性平板，都不长……所以我怀疑是自己的连接出了问题，不知道猜想对不对？求各位大侠赐教。 难道是连接后需要纯化吗？但是请教了别的实验室的人，都说一般不需要纯化，都是直接转化的呀~涂板时也注意将涂布器凉了再涂的呀，应该不会将细菌高温杀死了啊？也没敢涂的时间太久啊，大概每块板就两三分钟吧，也应该不会导致细菌死亡啊？……哪里的问题呢？ 连接时的操作都需要注意些什么呢？跪求各位指点啊！跪求……  我这只大菜鸟…… -------------------------------------------------------------------------------------------------- 首先PCR后跑电泳检测，全部上样，割胶回收。然后连接。 连接我做了两组（均为TaKaRa产品）： 1、 10xT4连接Buffer 1ul pMD 18 T 载体 1ul T4 DNA 连接酶 1ul 割胶回收PCR产物 7ul 2、 pMD 18 T 载体 1ul 割胶回收PCR产物 4ul Solution 1 5ul 两者均为16摄氏度连接过夜，我还怕温度不准，放在了PCR仪里，取出来时看了时间，14个小时多，按理说肯定该连接好了。但是转化大肠杆菌后不长。 PCR我也是重新做的，就是想着用新鲜的PCR产物，载体是问别人借的，因为实验室正好用完了，但是别人每次都可以连接成功的……所以我就搞不懂是哪里的问题了，难道是我的酶有问题？ [ Last edited by 西瓜 on 2011-6-8 at 16:05 ] |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 【分子生物】EPI帖 | 核酸生物学实验经验 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
西瓜» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有87人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 《转》华为的狼性——8年女硕离职实录：我为什么离开？
已经有7人回复
- 怎么看施一公在清华大学演讲?
已经有12人回复
- flac3d ，为何爱你这么难
已经有7人回复
- 人工智能危险吗？嗯…很难说
已经有2人回复
- 重识路遥（上）
已经有4人回复
- 寒门难再出贵子（2）
已经有30人回复
- 美国人究竟吃不吃转基因食物？
已经有71人回复
- 三电极CV曲线，为什么电流这么低呢？
已经有39人回复
- “绿色”水泥简史
已经有7人回复
- android NDk环境编译-----原创总结
已经有9人回复
- 普通高校老师的青年基金经验
已经有102人回复
- 极好的分析长难句的文章！以前收藏的，与大家分享一下，觉得好就顶！！
已经有10人回复
- 有智商没情商 好学生为什么不一定是好员工
已经有29人回复
- 关于《为什么生物类专业这么难就业》的感想
已经有33人回复
9楼2011-06-08 10:35:57
西瓜
荣誉版主 (知名作家)
- MolEPI: 50
- 应助: 94 (初中生)
- 贵宾: 3.157
- 金币: 1849.6
- 散金: 11458
- 红花: 116
- 沙发: 21
- 帖子: 7553
- 在线: 1449.5小时
- 虫号: 271749
- 注册: 2006-08-13
- 性别: GG
- 专业: 细胞衰老
- 管辖: 分子生物
2楼2011-06-07 23:20:46
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5): good 2011-06-08 10:16:54
dhd997(金币+5): good 2011-06-08 10:16:54
|
本帖内容被屏蔽 |
3楼2011-06-08 08:26:47
4楼2011-06-08 08:41:23
投票:
