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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 为什么我做的酶切连接总是不长斑呢？
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yoyoyoyo3985

金虫 (小有名气)

[求助] 为什么我做的酶切连接总是不长斑呢？

我的目标DNA现在是上到了T载体上，两端都加了酶切位点的。现在做的是将DNA双酶切回收，然后与双酶切回收的表达载体连接、转化。表达载体是有amp抗性的，可是做了几次，板子上都没有斑长出来。求各位大侠给予指点啊。
说明：酶切应该没问题的，因为胶回收的时候明显是分为两条带了，DNA的浓度也不错，感受态用空载体转化的生长状况也正常，难道是T4连接酶的问题吗？
我用的酶说明上是22度10min-1h。我都是连了数小时
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难免埋怨时间的手，把相爱写成相爱过
1楼 2011-05-10 09:24:08
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

太极拳

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

yoyoyoyo3985(金币+1): 谢谢支持 2011-05-10 10:22:12
这个季节构建载体都不尽如人意，建议楼主换个载体试试，敢问楼主目的片段多大，载体多大？
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4楼2011-05-10 10:13:29
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丑牛1973

银虫 (初入文坛)
1.双酶切时候，要每个酶都单酶切一次，以确认酶切位点和酶都没问题
2.设置对照
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20楼2011-06-30 16:54:44
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普通回帖

yoyoyoyo3985

金虫 (小有名气)
没人支持啊……
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难免埋怨时间的手，把相爱写成相爱过
2楼2011-05-10 09:41:31
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漫舞清风

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

yoyoyoyo3985(金币+1): amp和感受态应该没问题，空载体是可以正常生长的 2011-05-10 10:11:31
想问一下Amp储液的浓度？是不是浓度过高了。还有一种情况就是载体根本就没进入菌株中，原因可能是感受态不好。
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3楼2011-05-10 09:55:21
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yoyoyoyo3985

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 太极拳 at 2011-05-10 10:13:29:
这个季节构建载体都不尽如人意，建议楼主换个载体试试，敢问楼主目的片段多大，载体多大？

载体有4800，目的片段为1900.因为是在做昆虫表达，所以必须上这个载体……
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难免埋怨时间的手，把相爱写成相爱过
5楼2011-05-10 10:18:27
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appleXYJ

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

yoyoyoyo3985(金币+2): 谢谢支持 2011-05-10 10:22:02
请问用什么连接酶，我通常是4度连接过夜，还有片段与T载体的比例关系，增大片段的浓度试试。如果经费允许，买感受态效果会好点！
阳性对照做了吗--必须做，这样好找原因
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6楼2011-05-10 10:18:58
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yoyoyoyo3985

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by appleXYJ at 2011-05-10 10:18:58:
请问用什么连接酶，我通常是4度连接过夜，还有片段与T载体的比例关系，增大片段的浓度试试。如果经费允许，买感受态效果会好点！
阳性对照做了吗--必须做，这样好找原因

T4连接酶，推荐温度是22度，我就按照这个温度来的。
我在想应该是酶或者比例关系的问题吧？
阳性对照应该怎么做呢
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难免埋怨时间的手，把相爱写成相爱过
7楼2011-05-10 10:23:32
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whiskyxy

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

表达载体酶切是否有问题？
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8楼2011-05-10 10:41:52
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

yoyoyoyo3985(金币+1): 谢谢 2011-05-10 11:54:37
silicare(EPI+1): 2011-05-10 13:32:41
1：首先你要确定你酶切的载体和酶切的基因是完全酶切的，没有任何问题；
2：其次连接的温度和时间问题还有体系的选择，一般基因比载体多一些。。。
3：转化涂布时候抗生素呢？有没有问题，浓度对吗？筛选标记呢？
总之，出现问题了，要想想每一步的操作。。。
如果同样的体系做了好多次没有结果，就换体系。。。
祝好运！
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
9楼2011-05-10 11:05:40
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appleXYJ

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
Originally posted by yoyoyoyo3985 at 2011-05-10 10:23:32:
T4连接酶，推荐温度是22度，我就按照这个温度来的。
我在想应该是酶或者比例关系的问题吧？
阳性对照应该怎么做呢

有的T载体中带有阳性对照的片段，你也可以找人借曾连接上的片段试试，看看你的整个过程有没有问题。
最后涂板时离心，去部分上清，再涂，可能好些！
希望对你有帮助！
祝顺利
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10楼2011-05-10 12:39:58
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