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yoyoyoyo3985

金虫 (小有名气)

[求助] 为什么我做的酶切连接总是不长斑呢?

我的目标DNA现在是上到了T载体上,两端都加了酶切位点的。现在做的是将DNA双酶切回收,然后与双酶切回收的表达载体连接、转化。表达载体是有amp抗性的,可是做了几次,板子上都没有斑长出来。求各位大侠给予指点啊。
说明:酶切应该没问题的,因为胶回收的时候明显是分为两条带了,DNA的浓度也不错,感受态用空载体转化的生长状况也正常,难道是T4连接酶的问题吗?
我用的酶说明上是22度10min-1h。我都是连了数小时
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难免埋怨时间的手,把相爱写成相爱过
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太极拳

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

yoyoyoyo3985(金币+1): 谢谢支持 2011-05-10 10:22:12
这个季节构建载体都不尽如人意,建议楼主换个载体试试,敢问楼主目的片段多大,载体多大?
4楼2011-05-10 10:13:29
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丑牛1973

银虫 (初入文坛)

1.双酶切时候,要每个酶都单酶切一次,以确认酶切位点和酶都没问题
2.设置对照
20楼2011-06-30 16:54:44
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普通回帖

yoyoyoyo3985

金虫 (小有名气)

没人支持啊……
难免埋怨时间的手,把相爱写成相爱过
2楼2011-05-10 09:41:31
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漫舞清风

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

yoyoyoyo3985(金币+1): amp和感受态应该没问题,空载体是可以正常生长的 2011-05-10 10:11:31
想问一下Amp储液的浓度?是不是浓度过高了。还有一种情况就是载体根本就没进入菌株中,原因可能是感受态不好。
3楼2011-05-10 09:55:21
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yoyoyoyo3985

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 太极拳 at 2011-05-10 10:13:29:
这个季节构建载体都不尽如人意,建议楼主换个载体试试,敢问楼主目的片段多大,载体多大?

载体有4800,目的片段为1900.因为是在做昆虫表达,所以必须上这个载体……
难免埋怨时间的手,把相爱写成相爱过
5楼2011-05-10 10:18:27
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appleXYJ

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

yoyoyoyo3985(金币+2): 谢谢支持 2011-05-10 10:22:02
请问用什么连接酶,我通常是4度连接过夜,还有片段与T载体的比例关系,增大片段的浓度试试。如果经费允许,买感受态效果会好点!
阳性对照做了吗--必须做,这样好找原因
6楼2011-05-10 10:18:58
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yoyoyoyo3985

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by appleXYJ at 2011-05-10 10:18:58:
请问用什么连接酶,我通常是4度连接过夜,还有片段与T载体的比例关系,增大片段的浓度试试。如果经费允许,买感受态效果会好点!
阳性对照做了吗--必须做,这样好找原因

T4连接酶,推荐温度是22度,我就按照这个温度来的。
我在想应该是酶或者比例关系的问题吧?
阳性对照应该怎么做呢
难免埋怨时间的手,把相爱写成相爱过
7楼2011-05-10 10:23:32
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whiskyxy

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

表达载体酶切是否有问题?
8楼2011-05-10 10:41:52
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

yoyoyoyo3985(金币+1): 谢谢 2011-05-10 11:54:37
silicare(EPI+1): 2011-05-10 13:32:41
1:首先你要确定你酶切的载体和酶切的基因是完全酶切的,没有任何问题;
2:其次连接的温度和时间问题还有体系的选择,一般基因比载体多一些。。。
3:转化涂布时候抗生素呢?有没有问题,浓度对吗?筛选标记呢?
总之,出现问题了,要想想每一步的操作。。。
如果同样的体系做了好多次没有结果,就换体系。。。
祝好运!
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
9楼2011-05-10 11:05:40
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appleXYJ

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
Originally posted by yoyoyoyo3985 at 2011-05-10 10:23:32:
T4连接酶,推荐温度是22度,我就按照这个温度来的。
我在想应该是酶或者比例关系的问题吧?
阳性对照应该怎么做呢

有的T载体中带有阳性对照的片段,你也可以找人借曾连接上的片段试试,看看你的整个过程有没有问题。
最后涂板时离心,去部分上清,再涂,可能好些!
希望对你有帮助!
祝顺利
10楼2011-05-10 12:39:58
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