应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 为什么我做的酶切连接总是不长斑呢？
253/3返回列表上一页123
查看: 2921  |  回复: 24
只看楼主@他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 BioEPI ，点击这里进行查看

toxicpeach

木虫 (正式写手)
楼主的问题讲得不是很清楚：
1.你用的是什么样的酶做的双酶切呢？粘性末端还是平末端，平末端一般较难连接，有的粘末端酶也要用平末端酶连接条件，如Takara公司的XhoI。通常16度过夜连接是最能保证效果的。
2. 一个斑都没有？载体酶切相当不错哦，通常我们会遇到的问题是不去磷酸化的载体片段连接酶切片段后混有没有酶切干净的载体，你确定你的抗生素没有问题么？你的感受态细胞是什么呢？以前遇到一种Amp，转化Dh5a没有影响，BL21涂布上去一个都不长，不过你说空载体转化正常，或许可以排除这一原因。
3.之前用国产试剂盒做纯化，连接转化都很困难，用进口的就好很多。
4.以前将一个3400bp左右的基因连上4700bp的载体用的摩尔比例大约是7:1，可以供楼主参考下。
5.天气热的时候实验是要困难一些。
希望楼主能够早点找到原因，解决问题罗。
赞一下 回复此楼
海纳百川有容乃大，壁立千尺无欲则刚
21楼2011-07-01 00:21:27
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

amilie030312

金虫 (正式写手)
1、像上面说到的先确定你酶切没问题，这里我所说的没问题第一是没有切错否则片段不对，第二酶不能有污染否则连接肯定不成功。
2、如果酶有污染有时会片段末端切掉几个碱基，连接酶效率再低些就连不上了，我们通常酶切会选择4碱基突出的末端，因为最好连，但如果内切酶有污染就会切出非4碱基突出的，那连接时就很难连了，但酶切电泳图看不出来就是连不上。
3、如果感受态细胞确定没问题那么看下是否是连接时酶和DNA量不对，导致连接步骤出问题了。
4、是否抗生素加多了，我以前就有一次算浓度时算错了两个小数点，结果就啥也没长。
总之，基因克隆这东西说神奇吧也简单，说简单吧还挺繁杂，反正一环扣一环，不能说没长斑就想是连接酶的问题，应该说每一步出了问题都会导致克隆不成功的，所以细心再梳理一遍实验肯定能找到原因的。
赞一下 回复此楼
22楼2011-07-01 10:00:49
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sunningheart

铁虫 (初入文坛)
换一下连接体系，目的片段与载体的比例大些，也许情况会有所改变。祝好运~~
赞一下 回复此楼
23楼2012-09-05 10:29:20
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

odelay

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by appleXYJ at 2011-05-10 10:18:58
请问用什么连接酶，我通常是4度连接过夜，还有片段与T载体的比例关系，增大片段的浓度试试。如果经费允许，买感受态效果会好点！
阳性对照做了吗--必须做，这样好找原因

片段和T载体的比例一般是多少啊
赞一下 回复此楼
24楼2014-12-18 10:58:53
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

odelay

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by yabxxh at 2011-05-10 14:41:27
呵呵，不知道你用的哪家的连接酶，怎么会有这样的温度和时间。
    首先来讲温度的话，除非你做亚克隆，或者你片段GC含量过高，都是16度最好，而且最好用PCR控温。当然试剂盒用22也是有他自己的目的的。
    其次 ...

载体和目的片段的比例是多少比较好啊。谢谢
赞一下 回复此楼
25楼2014-12-18 11:00:38
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 yoyoyoyo3985 的主题更新
253/3返回列表上一页123
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭