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yoyoyoyo3985

金虫 (小有名气)

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[求助] 为什么我做的酶切连接总是不长斑呢？

我的目标DNA现在是上到了T载体上，两端都加了酶切位点的。现在做的是将DNA双酶切回收，然后与双酶切回收的表达载体连接、转化。表达载体是有amp抗性的，可是做了几次，板子上都没有斑长出来。求各位大侠给予指点啊。
说明：酶切应该没问题的，因为胶回收的时候明显是分为两条带了，DNA的浓度也不错，感受态用空载体转化的生长状况也正常，难道是T4连接酶的问题吗？
我用的酶说明上是22度10min-1h。我都是连了数小时

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难免埋怨时间的手，把相爱写成相爱过

1楼 2011-05-10 09:24:08

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yabxxh

木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★
silicare(金币+2): 谢谢参与，连接酶的种类有好多种~ 2011-05-10 15:26:23

呵呵，不知道你用的哪家的连接酶，怎么会有这样的温度和时间。
首先来讲温度的话，除非你做亚克隆，或者你片段GC含量过高，都是16度最好，而且最好用PCR控温。当然试剂盒用22也是有他自己的目的的。
其次，你的片段相对于载体已经很大了，你买的T4不是快速地把，其实快速连接酶在连接小片段的时候还比较有优势，但是大片段的载体构建，并无任何优势可言。
大片段的载体构建还是要老老实实的16度过夜连接，这样才能保证连接效率，因为大分子间的连接牵涉到空间构象的问题。
还有一个很重要的是你的载体和目的片段的摩尔比，这个有经验的人可以考肉眼来片段两者应加的体积比，没有经验的就老老实实的去测个OD吧，实践证明测OD还是很有效的。
最后你的目的片段的浓度一定要够高，太低了不行的。
祝，好运