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yoyoyoyo3985金虫 (小有名气)
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[求助]
为什么我做的酶切连接总是不长斑呢？
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我的目标DNA现在是上到了T载体上，两端都加了酶切位点的。现在做的是将DNA双酶切回收，然后与双酶切回收的表达载体连接、转化。表达载体是有amp抗性的，可是做了几次，板子上都没有斑长出来。求各位大侠给予指点啊。 说明：酶切应该没问题的，因为胶回收的时候明显是分为两条带了，DNA的浓度也不错，感受态用空载体转化的生长状况也正常，难道是T4连接酶的问题吗？ 我用的酶说明上是22度10min-1h。我都是连了数小时 |
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1、像上面说到的先确定你酶切没问题，这里我所说的没问题第一是没有切错否则片段不对，第二酶不能有污染否则连接肯定不成功。 2、如果酶有污染有时会片段末端切掉几个碱基，连接酶效率再低些就连不上了，我们通常酶切会选择4碱基突出的末端，因为最好连，但如果内切酶有污染就会切出非4碱基突出的，那连接时就很难连了，但酶切电泳图看不出来就是连不上。 3、如果感受态细胞确定没问题那么看下是否是连接时酶和DNA量不对，导致连接步骤出问题了。 4、是否抗生素加多了，我以前就有一次算浓度时算错了两个小数点，结果就啥也没长。 总之，基因克隆这东西说神奇吧也简单，说简单吧还挺繁杂，反正一环扣一环，不能说没长斑就想是连接酶的问题，应该说每一步出了问题都会导致克隆不成功的，所以细心再梳理一遍实验肯定能找到原因的。 |
22楼2011-07-01 10:00:49
3楼2011-05-10 09:55:21
4楼2011-05-10 10:13:29
yoyoyoyo3985
金虫 (小有名气)
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5楼2011-05-10 10:18:27