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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 为什么我做的酶切连接总是不长斑呢？
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beautybanana

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

Table2. pMD18-T vector ligation system
pMD18-T                        1uL
DNA template        4uL
Solution I                        5uL
Total                        10uL

16℃保温3～4h后，全量（10uL）转化至150uL的E.coli DH5α的感受态细胞。
上面是我以前做链接转化的方法，还有感受态细胞要保证能用，多做几管，也许就有菌斑了。
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11楼2011-05-10 14:31:37
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yabxxh

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
silicare(金币+2): 谢谢参与，连接酶的种类有好多种~ 2011-05-10 15:26:23
呵呵，不知道你用的哪家的连接酶，怎么会有这样的温度和时间。
    首先来讲温度的话，除非你做亚克隆，或者你片段GC含量过高，都是16度最好，而且最好用PCR控温。当然试剂盒用22也是有他自己的目的的。
    其次，你的片段相对于载体已经很大了，你买的T4不是快速地把，其实快速连接酶在连接小片段的时候还比较有优势，但是大片段的载体构建，并无任何优势可言。
大片段的载体构建还是要老老实实的16度过夜连接，这样才能保证连接效率，因为大分子间的连接牵涉到空间构象的问题。
    还有一个很重要的是你的载体和目的片段的摩尔比，这个有经验的人可以考肉眼来片段两者应加的体积比，没有经验的就老老实实的去测个OD吧，实践证明测OD还是很有效的。
最后你的目的片段的浓度一定要够高，太低了不行的。
祝，好运
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12楼2011-05-10 14:41:27
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yoyoyoyo3985

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by beautybanana at 2011-05-10 14:31:37:
Table2. pMD18-T vector ligation system
pMD18-T                        1uL
DNA template        4uL
Solution I                        5uL
Total                        10uL

16℃保温3～4h后，全量（10uL）转化至150uL的E.coli ...

非常感谢
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难免埋怨时间的手，把相爱写成相爱过
13楼2011-05-10 16:06:59
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yoyoyoyo3985

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yabxxh at 2011-05-10 14:41:27:
呵呵，不知道你用的哪家的连接酶，怎么会有这样的温度和时间。
    首先来讲温度的话，除非你做亚克隆，或者你片段GC含量过高，都是16度最好，而且最好用PCR控温。当然试剂盒用22也是有他自己的目的的。
    其 ...

嗯嗯,学习了,非常感谢
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难免埋怨时间的手，把相爱写成相爱过
14楼2011-05-10 16:07:32
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)

让一切随风飞翔

【答案】应助回帖

★ ★ ★
lstt09nk(金币+3): 鼓励下 2011-05-11 18:43:56
这是前段时间一直困扰我的问题，不过现在解决了。
首先，你得保证连接体系中各片段DNA的质量（包括浓度和纯度），这个很重要，当初我就是因为使用了TBE切胶，多做了两个月实验都不出结果（国内的胶回收试剂盒最好用TAE做缓冲液）。
连接前可以42度热击几分钟再加连接酶，16°C过夜。
下面就是转化了，一定要做对照（阳性and阴性），这样才能保证你的各种条件没问题。
总之，好运吧！
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一直向前！
15楼2011-05-10 16:07:46
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yoyoyoyo3985

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yabxxh at 2011-05-10 14:41:27:
呵呵，不知道你用的哪家的连接酶，怎么会有这样的温度和时间。
    首先来讲温度的话，除非你做亚克隆，或者你片段GC含量过高，都是16度最好，而且最好用PCR控温。当然试剂盒用22也是有他自己的目的的。
    其 ...

我现在的目的基因在T载体上,想将它切下来上表达载体,用的酶是快速连接酶哦,这是不是有问题?
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难免埋怨时间的手，把相爱写成相爱过
16楼2011-05-10 16:12:57
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yoyoyoyo3985

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zhangxn2010 at 2011-05-10 16:07:46:
这是前段时间一直困扰我的问题，不过现在解决了。
首先，你得保证连接体系中各片段DNA的质量（包括浓度和纯度），这个很重要，当初我就是因为使用了TBE切胶，多做了两个月实验都不出结果（国内的胶回收试剂盒最好 ...

谢谢,以前没试过热激
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难免埋怨时间的手，把相爱写成相爱过
17楼2011-05-10 16:15:19
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雪山飞狐7233

铁杆木虫 (著名写手)

铁杆小虫

【答案】应助回帖

16度连接过夜吧。
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梦在路就在！
18楼2011-05-10 17:43:42
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yoyoyoyo3985

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 雪山飞狐7233 at 2011-05-10 17:43:42:
16度连接过夜吧。

快速链接酶过夜链接也是没问题的吧？
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19楼2011-05-11 10:09:25
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丑牛1973

银虫 (初入文坛)
1.双酶切时候，要每个酶都单酶切一次，以确认酶切位点和酶都没问题
2.设置对照
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20楼2011-06-30 16:54:44
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