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yoyoyoyo3985

金虫 (小有名气)

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[求助] 为什么我做的酶切连接总是不长斑呢？

我的目标DNA现在是上到了T载体上，两端都加了酶切位点的。现在做的是将DNA双酶切回收，然后与双酶切回收的表达载体连接、转化。表达载体是有amp抗性的，可是做了几次，板子上都没有斑长出来。求各位大侠给予指点啊。
说明：酶切应该没问题的，因为胶回收的时候明显是分为两条带了，DNA的浓度也不错，感受态用空载体转化的生长状况也正常，难道是T4连接酶的问题吗？
我用的酶说明上是22度10min-1h。我都是连了数小时

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难免埋怨时间的手，把相爱写成相爱过

1楼 2011-05-10 09:24:08

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toxicpeach

木虫 (正式写手)

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楼主的问题讲得不是很清楚：
1.你用的是什么样的酶做的双酶切呢？粘性末端还是平末端，平末端一般较难连接，有的粘末端酶也要用平末端酶连接条件，如Takara公司的XhoI。通常16度过夜连接是最能保证效果的。
2. 一个斑都没有？载体酶切相当不错哦，通常我们会遇到的问题是不去磷酸化的载体片段连接酶切片段后混有没有酶切干净的载体，你确定你的抗生素没有问题么？你的感受态细胞是什么呢？以前遇到一种Amp，转化Dh5a没有影响，BL21涂布上去一个都不长，不过你说空载体转化正常，或许可以排除这一原因。
3.之前用国产试剂盒做纯化，连接转化都很困难，用进口的就好很多。
4.以前将一个3400bp左右的基因连上4700bp的载体用的摩尔比例大约是7:1，可以供楼主参考下。
5.天气热的时候实验是要困难一些。
希望楼主能够早点找到原因，解决问题罗。