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shuihaizi

金虫 (小有名气)

[交流] 做一个克隆所需的最短时间？比比谁更高效快速！

克隆一个基因：
第一天：小体系PCR（上午）-大体系回收（下午）-小样酶切-大体系酶切回收（包括载体）（晚上）-连接
第二天：早晨转化-晚上摇菌
第三天：PCR鉴定和提质粒酶切鉴定（上午提，下午鉴定）
一切顺利的情况下，紧忙乎，有没有更快更更高效的体系啊？
求交流！
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1楼 2011-08-09 22:09:15
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)
shuihaizi(金币+1): 2011-08-10 16:43:24
这个速度很正常
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2楼2011-08-09 22:49:02
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cloverplm

金虫 (小有名气)
★
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shuihaizi(金币+1): 2011-08-10 16:33:51
哎，一般都是这个样子的啦，公司效率会高一点，因为有很多机器，很多Items可以同时做。
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3楼2011-08-09 22:53:26
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wzqno

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
shuihaizi(金币+1): 2011-08-10 16:34:01
基本上最快也就这速度了，你可以用NEB的内切酶，一个小时搞定酶切，稍微快点
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4楼2011-08-10 10:45:23
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
dhd997(金币+3): good 2011-08-10 12:12:02
shuihaizi(金币+1): 2011-08-10 16:34:40
原先在公司做的时候时间是这么安排的：
第一天：小体系PCR（上午）-大体系回收（下午）-小样酶切-大体系酶切回收（包括载体）（晚上）-连接转化
第二天：早上摇菌，1小时候菌落PCR验证，大概中午能出菌检结果，下午可以酶切验证或测序
fermentas的普通T4连接酶，我22℃连半个小时足够了，所以晚上连接转化可以一起做。
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6楼2011-08-10 11:37:07
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haohaoman

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
dhd997(金币+3): 牛啊 2011-08-10 12:12:17
shuihaizi(金币+3): 2011-08-10 16:35:50
看来你们很慵懒吗。
本人实验室做实验情况。
第一天：直接50ul体系PCR,5UL检测，剩下回收，NEB 5min酶切，回收，NEB T4 连接1小时，转化，涂板。基本中午能完成。TG1 8个小时就有斑长出，网上10点摇菌。
第二天：提质粒，酶切鉴定，上午肯定能搞定。
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西瓜
7楼2011-08-10 11:49:04
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roomofxw

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
shuihaizi(金币+1): 2011-08-10 16:36:09
引用回帖:
7楼: Originally posted by haohaoman at 2011-08-10 11:49:04:
看来你们很慵懒吗。
本人实验室做实验情况。
第一天：直接50ul体系PCR,5UL检测，剩下回收，NEB 5min酶切，回收，NEB T4 连接1小时，转化，涂板。基本中午能完成。TG1 8个小时就有斑长出，网上10点摇菌。
第二天 ...

嗯，确实
快速内切酶和提高问题减少连接时间，可以节省不少时间。只要做好对照就没什么问题。
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8楼2011-08-10 13:30:24
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duke01361

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
shuihaizi(金币+1): 2011-08-10 16:36:47
没必要图快，要求成功率
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10楼2011-08-10 14:14:31
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shuihaizi

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 空谷幽风 at 2011-08-10 11:37:07:
原先在公司做的时候时间是这么安排的：
第一天：小体系PCR（上午）-大体系回收（下午）-小样酶切-大体系酶切回收（包括载体）（晚上）-连接转化
第二天：早上摇菌，1小时候菌落PCR验证，大概中午能出菌检结果 ...

你们用的是什么酶啊（PCR,连接酶）？用什么试剂盒回收啊？你说的菌落pcr能详细点吗？还是直接用1h的菌液就可以直接PCR了，体系是怎样的呢？
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11楼2011-08-10 16:39:42
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shuihaizi

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by dongkaiyu430 at 2011-08-10 10:50:26:

做T载体连接是挺快的，那要是载体也要酶切呢，有更好的建议吗？谢谢！
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12楼2011-08-10 16:42:48
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
送鲜花一朵
引用回帖:
7楼: Originally posted by haohaoman at 2011-08-10 11:49:04:
看来你们很慵懒吗。
本人实验室做实验情况。
第一天：直接50ul体系PCR,5UL检测，剩下回收，NEB 5min酶切，回收，NEB T4 连接1小时，转化，涂板。基本中午能完成。TG1 8个小时就有斑长出，网上10点摇菌。
第二天 ...

很快，确实！现在快酶的价格也贵不了多少了呢。
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13楼2011-08-10 18:05:47
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+3): 鼓励分享经验 2011-08-11 12:04:05
shuihaizi(金币+3): 2011-08-11 13:18:23
引用回帖:
11楼: Originally posted by shuihaizi at 2011-08-10 16:39:42:
你们用的是什么酶啊（PCR,连接酶）？用什么试剂盒回收啊？你说的菌落pcr能详细点吗？还是直接用1h的菌液就可以直接PCR了，体系是怎样的呢？

PCR 用pfu  或者PBO；连接酶用fermentas的T4连接酶，不过buffer我们公司自己配的，后来我试了一下他们公司带的buffer，也挺好用的；
菌落PCR就是先挑单菌落在200ml的培养基中摇菌1h，然后取2.5ul做PCR（30ul反应体系）
反应体系                    体积         
H2O                                     23 μl   
10 ×PCR缓冲液             3 μl  
正向引物 (50pmol/μl)           0.5 μl                           
反向引物 (50pmol/μl)           0.5μl      
DNTP (10mmol/L each)           0.3 μl         
菌液                       2.5 μl
Taq DNA聚合酶 (5U/μl)         0.2 μl                        
总体系                    30 μl
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14楼2011-08-10 19:34:51
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疯狂修行者

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+2): 这个很有道理。保证不出错就是最快的方法！ 2011-08-11 12:04:36
疯狂的对决，但是有么有想过，但凡有一部出了问题，就可能要花好多天才能解决。所以还不如慢慢做，实验不是着急来的。
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15楼2011-08-11 08:36:24
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天使托

专家顾问 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
shuihaizi(金币+1): 2011-08-11 13:17:19
看来大家都很牛叉了。。。本人一切顺利的话最多3.5天搞定一个克隆，当然了，如果熬夜的话2天即可！
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16楼2011-08-11 12:01:45
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friya0910

新虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
shuihaizi(金币+1): 2011-08-15 12:46:22
引用回帖:
1楼: Originally posted by shuihaizi at 2011-08-09 22:09:15:
克隆一个基因：
第一天：小体系PCR（上午）-大体系回收（下午）-小样酶切-大体系酶切回收（包括载体）（晚上）-连接
第二天：早晨转化-晚上摇菌
第 ...

有一个小疑问，早晨转化完晚上就可以摇菌了吗？中间不是还要涂平板培养12-16小时的吗？
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17楼2011-08-15 10:13:29
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shuihaizi

金虫 (小有名气)
★
西瓜(金币+1): 鼓励 2011-08-15 13:05:09
引用回帖:
16楼: Originally posted by 天使托 at 2011-08-11 12:01:45:
看来大家都很牛叉了。。。本人一切顺利的话最多3.5天搞定一个克隆，当然了，如果熬夜的话2天即可！

涂板是转化的其中的一个步骤，转化后是37度培养。
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18楼2011-08-15 12:47:21
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roomofxw

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+2): 是啊~ 2011-08-15 13:05:20
引用回帖:
15楼: Originally posted by 疯狂修行者 at 2011-08-11 08:36:24:
疯狂的对决，但是有么有想过，但凡有一部出了问题，就可能要花好多天才能解决。所以还不如慢慢做，实验不是着急来的。

科研实验的时候，可以慢慢做，没必要着急。
可是，公司是需要通量和速度的。
再者，快速实验的路线是合理的，正常操作实验结果是没有问题的，能省点时间就省点呗
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19楼2011-08-15 13:02:05
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邓远洪dyh

新虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
shuihaizi(金币+1): 3 2011-08-15 16:33:51
直接大体系PCR2小时，40分钟电泳检测，10分钟过柱回收PCR产物，40分钟回收产物检测，1小时连接（亚克隆连接时间适当加长）。半小时转化（亚克隆，冰浴时间适当延长），5分钟涂板，十小时挑斑于试管，八小时后提质粒，一小时酶切和pcr检测，30分钟电泳检测。完工。总用时不到一天
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21楼2011-08-15 15:13:18
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shuihaizi

金虫 (小有名气)
引用回帖:
21楼: Originally posted by 邓远洪dyh at 2011-08-15 15:13:18:
直接大体系PCR2小时，40分钟电泳检测，10分钟过柱回收PCR产物，40分钟回收产物检测，1小时连接（亚克隆连接时间适当加长）。半小时转化（亚克隆，冰浴时间适当延长），5分钟涂板，十小时挑斑于试管，八小时后提质 ...

PCR不摸条件直接就做，没有条带怎么办？
你用什么柱子回收只要10分钟啊？溶胶不得15分钟呢？
你连得是T载体吧？要是通过酶切位点那不得做酶切吗？
什么转化方法只要半小时？冰浴要30分钟，热激后摇就要30-45分钟。
请你详细介绍一下好吗？十分感谢！
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22楼2011-08-15 16:38:44
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roomofxw

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
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西瓜(金币+4): good 2011-08-16 11:52:27
shuihaizi(金币+2): 2011-08-23 16:18:42
另外IN FUSION，LIC等方法。连酶切连接一步都基本省掉了。更能节省时间。
看文献大规模高通量做构建的时候，均采用上述构建方法。
如果对PCR很有信心，是不是连切胶都可以省掉，直接过一遍PCR纯化柱。
另外现在的快速连接，5-10min搞定。、
最后质粒也不需要那么复杂，菌落PCR鉴定，甚至快检跑个电泳证明有插入基因。或者连鉴定都不鉴定（前提载体做得好）直接送测序，反正现在测序也便宜的很。
不过在学校的话，真是没有必要这么赶，认认真真老老实实，一步一步进行，做好对照，一次成功才是王道
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23楼2011-08-15 17:08:18
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sfb1020

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
实际也是那么快吗？我们实验室没有那么快
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24楼2011-08-15 17:15:31
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邓远洪dyh

新虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
shuihaizi(金币+3): 2011-08-16 11:14:19
西瓜(金币+4): 这都是经验啊 2011-08-16 11:52:12
引用回帖:
22楼: Originally posted by shuihaizi at 2011-08-15 16:38:44:
PCR不摸条件直接就做，没有条带怎么办？
你用什么柱子回收只要10分钟啊？溶胶不得15分钟呢？
你连得是T载体吧？要是通过酶切位点那不得做酶切吗？
什么转化方法只要半小时？冰浴要30分钟，热激后摇就要30-45分 ...

PCR不一定要摸条件，其实连接至需要很少量的DNA分子就够了，在你跑胶的时候只需要有隐约的条带就够了，甚至更少的两都行。 转化只需要冰浴15分钟足够了，过后的摇菌只是让感受态菌恢复。时间长短没事。柱子直接用DNA胶回收柱就可以了。  从你说的条件也是T载体的要求啊。  如果是亚克隆，可以把回收后的PCR产物直接进行酶切处理，然后再过柱回收。载体片段也可以同样的方法。因为像几十bp的小片段，回收柱回收不回来。所以都可以直接用DNA回收柱直接回收。
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25楼2011-08-16 09:00:22
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heroyl

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
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西瓜(金币+2): 呵呵，生物的成果都是钱砸出来的 2011-08-20 22:11:48
引用回帖:
7楼: Originally posted by haohaoman at 2011-08-10 11:49:04:
看来你们很慵懒吗。
本人实验室做实验情况。
第一天：直接50ul体系PCR,5UL检测，剩下回收，NEB 5min酶切，回收，NEB T4 连接1小时，转化，涂板。基本中午能完成。TG1 8个小时就有斑长出，网上10点摇菌。
第二天 ...

你这个貌似很快的样子，但是细看，首先你做PCR的时候是直接50ul体系做，简单一点、条带 短的、引物特异性好的情况下这样确实没问题，但是一般的做都是先小体系验证然后再大体系回收的。再看你用的试剂，看起来都是蛮贵的试剂，我相信大多数人用的不如你的，像你用NEB的内切酶，只要5Min，我们一般用TAKARA要切3、4小时！！因此我觉得你说我们慵懒是完全没道理的！！
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26楼2011-08-20 13:49:58
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haohaoman

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
26楼: Originally posted by heroyl at 2011-08-20 13:49:58:
你这个貌似很快的样子，但是细看，首先你做PCR的时候是直接50ul体系做，简单一点、条带 短的、引物特异性好的情况下这样确实没问题，但是一般的做都是先小体系验证然后再大体系回收的。再看你用的试剂，看起来都 ...

NEB的酶并没有大家想象的那么贵。常规酶的价格和takara的价格差不多。只不过NEB大包装的比较贵，如果换算成takara的小包装也是便宜的。
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27楼2011-08-21 11:13:48
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haohaoman

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
27楼: Originally posted by haohaoman at 2011-08-21 11:13:48:
NEB的酶并没有大家想象的那么贵。常规酶的价格和takara的价格差不多。只不过NEB大包装的比较贵，如果换算成takara的小包装也是便宜的。

现在的TAQ酶那么便宜，没必要从小体积做起。另外我说的是酶切链接，如果用T载体会更节省时间。我们都知道做分子其实是比较清闲的，做一步中间会有很多时间等待，所以按照我的速度下来不会很累。而且时间安排合理，应为摇菌的时间放在了晚上。
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28楼2011-08-21 11:17:29
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haohaoman

银虫 (小有名气)
引用回帖:
26楼: Originally posted by heroyl at 2011-08-20 13:49:58:
你这个貌似很快的样子，但是细看，首先你做PCR的时候是直接50ul体系做，简单一点、条带 短的、引物特异性好的情况下这样确实没问题，但是一般的做都是先小体系验证然后再大体系回收的。再看你用的试剂，看起来都 ...

认为NEB的比较贵，其实是感性认识。因为NEB的酶大包装比较多，所以一眼看上去很贵，平均到单位就很便宜额。另外给大家留下贵的印象是NEB的稀有酶，别人没有的的当然贵了。
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29楼2011-08-21 11:20:04
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shuihaizi

金虫 (小有名气)
请教：我没有金币了，怎么回帖评分啊？Thank YOU!谢谢大家这么关心这个话题
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西瓜
31楼2011-08-23 16:19:46
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
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引用回帖:
31楼: Originally posted by shuihaizi at 2011-08-23 16:19:46:
请教：我没有金币了，怎么回帖评分啊？Thank YOU!谢谢大家这么关心这个话题

好久不做克隆，回来翻旧帖学习下，呵呵~谢谢楼主发起有益的讨论！
金币可以在1楼，有个“追加悬赏金币”的按钮，点击之后可以追加金币
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32楼2011-10-11 07:56:12
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yuxia82012

木虫 (著名写手)
★
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一般三天吧，我克隆从来不酶切的，高保真酶扩增之后直接用Taq酶末端加A，连T载体，一小时后转化，第二天一般等到下午才挑单克隆摇菌，第三天快检提质粒酶切后测序
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33楼2011-10-11 14:05:23
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zgb1982

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
很多不懂，什么是小体系PCR，大体系回收
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34楼2012-05-09 10:15:20
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zqx128

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
1612820楼: Originally posted by zgb1982 at 2012-05-09 10:15:20
很多不懂，什么是小体系PCR，大体系回收

这都是简称，小体系PCR就是少做一点比如10微升、20微升的PCR反应体系来看看能不能扩增出目的带，如果能扩出来，就直接加大体积，比如50微升或100微升甚至更多来大量扩增，但是往PCR仪里放的时候要分成许多小管，扩增完了视情况直接过柱子纯化回收或者跑电泳切胶纯化回收，用来进行后续操作。
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35楼2012-06-28 16:31:03
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jasminezhao

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
1120645楼: Originally posted by 西瓜 at 2011-08-10 18:05:47
很快，确实！现在快酶的价格也贵不了多少了呢。...

我想请教一下，只取2.5ul菌液做PCR 要用200ml的培养基培养吗？是不是太多了点？谢谢！！
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36楼2013-01-04 16:51:20
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jasminezhao

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
1123895楼: Originally posted by 空谷幽风 at 2011-08-10 19:34:51
PCR 用pfu  或者PBO；连接酶用fermentas的T4连接酶，不过buffer我们公司自己配的，后来我试了一下他们公司带的buffer，也挺好用的；
菌落PCR就是先挑单菌落在200ml的培养基中摇菌1h，然后取2.5ul做PCR（30ul反应体 ...

我想请教一下，只取2.5ul菌液做PCR 要用200ml的培养基培养吗？是不是太多了点？谢谢！！
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37楼2013-01-04 16:58:25
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shuihaizi

金虫 (小有名气)
引用回帖:
1676197楼: Originally posted by jasminezhao at 2013-01-04 16:58:25
我想请教一下，只取2.5ul菌液做PCR 要用200ml的培养基培养吗？是不是太多了点？谢谢！！...

不多，可以。
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38楼2013-01-06 15:27:17
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san00niu

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我做了好几个月了都没做出来一个克隆！！！
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39楼2013-08-26 20:30:25
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weithermo

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
是啊，快速第二天中午就完成了。Fermentas 不存在了，现在是赛默飞世尔的分子生物学产品。他们有一整套的快酶。修饰酶，和PCR酶，及PCR克隆载体。www.thermoscientific.com/onebio
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40楼2013-08-27 04:34:16
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dongkaiyu4305楼
2011-08-10 10:50   回复  
nanocyq9楼
2011-08-10 13:43   回复  
blackrose808920楼
2011-08-15 13:15   回复  
引用回帖:
6楼: Originally posted by 空谷幽风 at 2011-08-10 11:37:07: 原先在公司做的时候时间是这么安排的： 第一天：小体系PCR（上午）-大体系回收（下午）-小样酶切-大体系酶切回收（包括载体）（晚上）-连接转化 第二天：早上摇菌，1小时候菌落PCR验证，大概中午能出菌检结果 ...

fruitbbs30楼
2011-08-21 16:38   回复  
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