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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】有关分子克隆发生突变的疑惑
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snowice

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】有关分子克隆发生突变的疑惑 已有6人参与

我在做克隆时挑了几个建好的阳性单克隆送去测序，结果每种的目的片段都有4-6个位点发生突变，而且每种突变的位点还不一样，想问一下是pcr的时候就产生了一系列有不同突变位点的目的片段还是在下面的几步中发生了突变，最可能是那种情况呢，我的目的片段1000多点，用的promega的taq。真后悔没用KOD plus。。。
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爱吃爱睡懒得要死的猪头
1楼 2010-05-21 22:07:52
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
循环数几个？普通的Taq对于1000多的片段，最好就是不要超过30个循环，2x个比较合适
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2楼2010-05-21 22:17:37
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snowice

银虫 (小有名气)
30个循环，就是感觉突变率太高了，那基本上就是在pcr的时候产生的突变了吗，主要是突变位点还不一样，不知道是不是在细菌中突变了？
另外 用pfu在1000多点很少出现突变吧，kod 用着感觉太烧钱
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-05-21 22:17:37:
循环数几个？普通的Taq对于1000多的片段，最好就是不要超过30个循环，2x个比较合适

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爱吃爱睡懒得要死的猪头
3楼2010-05-21 22:34:46
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gastrodia

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你的模板是否有问题，一般pfu在35个循环之内基本都不会发生突变
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4楼2010-05-21 22:48:20
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snowice

银虫 (小有名气)
模板是老板300美刀买一小日本的，不知道有没有测序，应该没有什么问题。如果排除模板的问题，单纯pcr也会出现这种产生有不同突变位点的目的片段吗，因为还有许多阳性克隆没去测序，不知道还要不要送测了。
那就用pfu重新p吧，话说1100的长度，pfu延伸2分钟够了吧。
引用回帖:
Originally posted by gastrodia at 2010-05-21 22:48:20:
你的模板是否有问题，一般pfu在35个循环之内基本都不会发生突变

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爱吃爱睡懒得要死的猪头
5楼2010-05-21 23:08:30
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+1):欢迎多多交流~~ 2010-05-22 14:32:02
引用回帖:
Originally posted by snowice at 2010-05-21 22:34:46:
30个循环，就是感觉突变率太高了，那基本上就是在pcr的时候产生的突变了吗，主要是突变位点还不一样，不知道是不是在细菌中突变了？
另外 用pfu在1000多点很少出现突变吧，kod 用着感觉太烧钱

KOD其实也不是很贵的~~不知道你买的是哪个牌子的KOD，TOYOBO的我用过，还行，虽然扩增能力远不如Invitrogen的白金Taq保真版，后者的保真度低一点，只有6X，但1000bp还是没问题的~~
pfu个人不大喜欢用……
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6楼2010-05-21 23:15:33
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snowice

银虫 (小有名气)
是TOYOBO的，之前用来做点突变，现在他家的kod plus neo 打六折 又去买了，200u，560。
我也很少用pfu。其实promega 的taq一般1000也没什么问题，这次没个克隆突变了5、6个 还都不一样，极品了
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-05-21 23:15:33:


KOD其实也不是很贵的~~不知道你买的是哪个牌子的KOD，TOYOBO的我用过，还行，虽然扩增能力远不如Invitrogen的白金Taq保真版，后者的保真度低一点，只有6X，但1000bp还是没问题的~~
pfu个人不大喜欢用……

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爱吃爱睡懒得要死的猪头
7楼2010-05-21 23:34:09
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biogefart

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
换家公司测一下序，
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闹太套
8楼2010-05-22 08:28:04
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langgenet
顶一下
9楼2010-05-22 09:23:01
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米菲的旋律

木虫 (著名写手)

Always Keep The Faith！
★
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现在不用toyobo 用takara的pyrobest
pfu太慢了
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物必先腐而后虫生
10楼2010-05-24 17:13:43
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