| 查看: 6056 | 回复: 15 | |||||
| 【奖励】 本帖被评价14次，作者空谷幽风增加金币 9.2 个 | |||||
[资源]
【专题】分子克隆实验专题--（五）感受态细胞的选择与使用
|
|||||
|
分子克隆实验专题--（五）感受态细胞的选择与使用 常用感受态细胞的特性： TOP10，DH5α：蓝白斑筛选，高效克隆，质粒抽提 JM110：甲基化酶缺陷型 SURE：克隆不稳定插入片段，降低同源重组 DH10B：文库构建，长片段质粒的克隆（150kp 质粒转化） Stbl2：克隆不稳定插入片段，正向重复，逆转录病毒序列，克隆甲基化基因组序列。 Stbl3：克隆慢病毒表达载体中的正向重复序列，降低逆转录病毒载体中长末端重复序列的非目标同源重组。 选择适宜的感受态细胞 序列的结构，长度，载体种类以及特殊要求等。 选择适宜的转化方式 热激转化：常规克隆，片段较短（<10kb) 电转化: 建库，基因敲除，长片段（>10kb) 感受态细胞使用的注意事项 连接产物或质粒的量 效价：1μg标准质粒转化感受态细胞产生的单克隆的数目，单位为cfu。 化学感受态细胞：106，107，108，109cfu 电转感受态细胞：108，109，1010cfu 常规的克隆根据连接产物和质粒的量选择适当效价的感受态细胞，特殊转化（如建库）则选择最高效价的感受态细胞，一般选用电转。 感受态细胞效价测定 标准质粒：pUC18, pUC19,pBR322 超螺旋，超纯 质粒使用量：<5μl, <1ng 设立阴性对照，多涂几板(3块以上）取平均值。 化学感受态细胞的使用 质粒PCR扩环的产物以及进行体内重组的线性片段不宜选用DH5α高效感受态细胞进行转化。 可能原因： DH5α本身不适合这种操作；高效感受态制备的试剂对于这种转化有抑制作用。 可选用TOP10感受态细胞。 电转感受态细胞的使用 尽量降低转化产物的离子浓度，防止细胞被击穿。 大量的连接产物提纯后进行转化，或者进行透析后再转化，有些进行体内重组的酶切产物进行提纯后进行转化。 氨苄平板的卫星菌落 氨苄平板涂板后如果时间太长，就会产生卫星菌落，在单克隆周围生成小的克隆。 氨苄抗生素只能抑制菌落生长，而不能杀死，当抗生素降解失效后，被抑制的菌体重新形成菌斑。 解决方法：使用新鲜配置的氨苄培养基平板，提高氨苄的使用量，选用高质量的氨苄抗生素。 感受态细胞的取用 特殊制备的感受态细胞在超低温条件下可以维持效价半年以上，在制成之后要立即放入超低温冰箱。 感受态细胞对温度的变化非常敏感，取用时要快取快放，不能将整包的细胞放在外面然后取用。 看清标记，防止拿错。 |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 分子实验常见问题 | 有价值的生物经验贴 | 好帖 |
» 猜你喜欢
含氟糖皮质激素的外用抗炎利器醋酸氟轻松
已经有0人回复
-
阿莫奈韦（Amenamevir）：解旋酶-引物酶靶向分子的结构特征与合成路径全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有101人回复
-
利瑞鲁单抗：靶向KIR的NK细胞检查点工具抗体，结构基础与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 【文献精读】法国 SIMAP-EPM 实验室关于金属液滴边界不稳定性的好文献一篇
已经有33人回复
- 关于自己实验和小老板实验的时间平衡
已经有59人回复
- 做发酵动力学实验时发酵培养基是否有什么要求
已经有5人回复
- 氧化铬，氧化亚铬的毒性有多高，实验时如何防范！！！
已经有9人回复
- 扫描电镜实验测试发现问题了，怎么办？？
已经有4人回复
- 深圳清华大学研究院生物医用材料及植入器械重点实验室招聘生物医用材料研发工程师
已经有9人回复
- 上海市绿色化学与化工过程绿色化重点实验室 - “英才学者”姜雪峰研究课题组招聘博士�
已经有4人回复
- 【分享】分子克隆实验专题-（二）酶切连接要点探讨
已经有15人回复
- 【分享】分子克隆实验专题开题通知
已经有7人回复
2楼2011-04-16 10:20:37
4楼2011-04-16 23:16:41
9楼2011-12-22 09:42:18
10楼2011-12-22 09:43:22
13楼2013-05-13 13:18:40
请教楼主，同样的方法做top10和stbl3都没问题，但是做stbl2却怎么也做不出来，请问怎么验证我的stbl2菌株是不是有问题？ 14楼2013-06-14 10:31:18
15楼2014-09-18 17:08:05
16楼2015-12-23 10:13:12
简单回复
西瓜3楼
2011-04-16 14:48
回复
三星好评 感谢分享
天使托5楼
2011-04-17 09:20
回复
五星好评 
Eche6楼
2011-10-15 09:21
回复
三星好评 
2011-12-02 14:12
回复
三星好评 
chchqq8楼
2011-12-04 17:43
回复
三星好评 
yanlinsu11楼
2012-03-29 16:15
回复
五星好评 
动力泉12楼
2012-05-13 13:58
回复
五星好评 
