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空谷幽风

金虫 (正式写手)

[资源] 【专题】分子克隆实验专题--（五）感受态细胞的选择与使用

分子克隆实验专题--（五）感受态细胞的选择与使用
常用感受态细胞的特性：
TOP10，DH5α：蓝白斑筛选，高效克隆，质粒抽提
JM110：甲基化酶缺陷型
SURE：克隆不稳定插入片段，降低同源重组
DH10B：文库构建，长片段质粒的克隆（150kp
   质粒转化）
Stbl2：克隆不稳定插入片段，正向重复，逆转录病毒序列，克隆甲基化基因组序列。
Stbl3：克隆慢病毒表达载体中的正向重复序列，降低逆转录病毒载体中长末端重复序列的非目标同源重组。

 选择适宜的感受态细胞
   序列的结构，长度，载体种类以及特殊要求等。
 选择适宜的转化方式
   热激转化：常规克隆，片段较短（<10kb)
   电转化: 建库，基因敲除，长片段（>10kb)

感受态细胞使用的注意事项

 连接产物或质粒的量
   效价：1μg标准质粒转化感受态细胞产生的单克隆的数目，单位为cfu。
   化学感受态细胞：106，107，108，109cfu
   电转感受态细胞：108，109，1010cfu
   常规的克隆根据连接产物和质粒的量选择适当效价的感受态细胞，特殊转化（如建库）则选择最高效价的感受态细胞，一般选用电转。

 感受态细胞效价测定
   标准质粒：pUC18, pUC19,pBR322
                     超螺旋，超纯
   质粒使用量：<5μl, <1ng
   设立阴性对照，多涂几板(3块以上）取平均值。
 化学感受态细胞的使用
   质粒PCR扩环的产物以及进行体内重组的线性片段不宜选用DH5α高效感受态细胞进行转化。
   可能原因： DH5α本身不适合这种操作；高效感受态制备的试剂对于这种转化有抑制作用。
      可选用TOP10感受态细胞。
 电转感受态细胞的使用
   尽量降低转化产物的离子浓度，防止细胞被击穿。
   大量的连接产物提纯后进行转化，或者进行透析后再转化，有些进行体内重组的酶切产物进行提纯后进行转化。
 氨苄平板的卫星菌落
   氨苄平板涂板后如果时间太长，就会产生卫星菌落，在单克隆周围生成小的克隆。
   氨苄抗生素只能抑制菌落生长，而不能杀死，当抗生素降解失效后，被抑制的菌体重新形成菌斑。
      解决方法：使用新鲜配置的氨苄培养基平板，提高氨苄的使用量，选用高质量的氨苄抗生素。

 感受态细胞的取用
   特殊制备的感受态细胞在超低温条件下可以维持效价半年以上，在制成之后要立即放入超低温冰箱。
   感受态细胞对温度的变化非常敏感，取用时要快取快放，不能将整包的细胞放在外面然后取用。
   看清标记，防止拿错。

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