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【专题】分子克隆实验专题--（五）感受态细胞的选择与使用
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分子克隆实验专题--（五）感受态细胞的选择与使用 常用感受态细胞的特性： TOP10，DH5α：蓝白斑筛选，高效克隆，质粒抽提 JM110：甲基化酶缺陷型 SURE：克隆不稳定插入片段，降低同源重组 DH10B：文库构建，长片段质粒的克隆（150kp 质粒转化） Stbl2：克隆不稳定插入片段，正向重复，逆转录病毒序列，克隆甲基化基因组序列。 Stbl3：克隆慢病毒表达载体中的正向重复序列，降低逆转录病毒载体中长末端重复序列的非目标同源重组。 选择适宜的感受态细胞 序列的结构，长度，载体种类以及特殊要求等。 选择适宜的转化方式 热激转化：常规克隆，片段较短（<10kb) 电转化: 建库，基因敲除，长片段（>10kb) 感受态细胞使用的注意事项 连接产物或质粒的量 效价：1μg标准质粒转化感受态细胞产生的单克隆的数目，单位为cfu。 化学感受态细胞：106，107，108，109cfu 电转感受态细胞：108，109，1010cfu 常规的克隆根据连接产物和质粒的量选择适当效价的感受态细胞，特殊转化（如建库）则选择最高效价的感受态细胞，一般选用电转。 感受态细胞效价测定 标准质粒：pUC18, pUC19,pBR322 超螺旋，超纯 质粒使用量：<5μl, <1ng 设立阴性对照，多涂几板(3块以上）取平均值。 化学感受态细胞的使用 质粒PCR扩环的产物以及进行体内重组的线性片段不宜选用DH5α高效感受态细胞进行转化。 可能原因： DH5α本身不适合这种操作；高效感受态制备的试剂对于这种转化有抑制作用。 可选用TOP10感受态细胞。 电转感受态细胞的使用 尽量降低转化产物的离子浓度，防止细胞被击穿。 大量的连接产物提纯后进行转化，或者进行透析后再转化，有些进行体内重组的酶切产物进行提纯后进行转化。 氨苄平板的卫星菌落 氨苄平板涂板后如果时间太长，就会产生卫星菌落，在单克隆周围生成小的克隆。 氨苄抗生素只能抑制菌落生长，而不能杀死，当抗生素降解失效后，被抑制的菌体重新形成菌斑。 解决方法：使用新鲜配置的氨苄培养基平板，提高氨苄的使用量，选用高质量的氨苄抗生素。 感受态细胞的取用 特殊制备的感受态细胞在超低温条件下可以维持效价半年以上，在制成之后要立即放入超低温冰箱。 感受态细胞对温度的变化非常敏感，取用时要快取快放，不能将整包的细胞放在外面然后取用。 看清标记，防止拿错。 |
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10楼2011-12-22 09:43:22
13楼2013-05-13 13:18:40
请教楼主，同样的方法做top10和stbl3都没问题，但是做stbl2却怎么也做不出来，请问怎么验证我的stbl2菌株是不是有问题？ 14楼2013-06-14 10:31:18
15楼2014-09-18 17:08:05
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