| 查看: 5393 | 回复: 15 | |||||||
| 【奖励】 本帖被评价14次，作者空谷幽风增加金币 10.8 个 | |||||||
[资源]
【分享】分子克隆实验专题-（二）酶切连接要点探讨
|
|||||||
|
分子克隆实验专题-（二）酶切连接要点探讨 声明：关于酶切连接的实验做法我在之前的帖子里已经非常详细的介绍了，原帖链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=2311683 我们在这里对相关问题进行探讨 1. 酶切 （1） PCR产物的酶切 ①酶切位点两端要有适当的保护碱基。一般在设计引物的时候会在新添加的酶切位点前加4-5个碱基当做保护碱基，这种保护碱基的序列没有特殊的要求，不要添加完后使你的引物不能用就行了（好引物应该具备的条件大家应该都知道吧） – NEB http://www.nebchina.com/cn/tech/re/cleavage_olig.htm – TaKaRa PCR产物末端限制酶切位点的切段情况 ②在保证不产生星号活性的情况下，适当延长酶切时间，但要注意核酸酶的污染。曾经用过fermentas的某种快切酶，切完后竟然会在酶切位点处多切掉1个碱基。 （2） 质粒DNA的酶切 ①不要选用临近的或交叉的酶切位点 如XbaI / BamHI/ SmaI TCTAGA GGATCCCGGG ②小心容易甲基化的酶切位点，如XbaI。这种情况下我们一般会把质粒重新转一下甲基化修饰缺陷的感受态细胞，比如JM110(关于感受态细胞的选择我会专门开一个专题单独介绍) 2.影响酶切效果的因素 双酶切反应体系 • TaKaRa: • Double Digestion 时的Universal Buffer的使用表 • NEB: • http://www.neb.com/nebecomm/DoubleDigestCalculator.asp • MBI： • http://www.fermentas.com/doubledigest/index.html • 分步酶切顺序的选择：选择适当的酶切顺序(低盐 -----高盐） 甲基化位点的影响 • 设计方案时尽量避免使用 • JM110 • PCR 扩增后再切 质粒DNA的质量与定量 • 质量：抽提过程中杂质的残留 • 定量：分步酶切时,酶切足够的DNA,保证第二步回收到浓度较高的载体或片段 酶切不完全 • 公用buffer选择不当 • 质粒DNA量过多 • 酶的活性不高 酶切出的小片段回收效率低 • PCR扩增后再酶切 • 回收上柱时加终浓度为20%的异丙醇 • Glass beads (> 40 bp) 3.影响连接的因素 （1） 片段的质量 片段回收时紫外线照射对克隆效率的影响 （2）摩尔比 In general, maximum cloning efficiency is achieved when using a 2:1 molar ratio of insert: vector. |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 分子实验常见问题 | 有价值的生物经验贴 | Enjoy my life！ | 好帖 |
| 核酸方面 |
» 猜你喜欢
留学--博士招生
已经有16人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有104人回复
-
湖北师范大学招调剂啦
已经有7人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
-
天津商业大学 生物与医药课题组招生
已经有0人回复
-
生物化工学硕招收调剂
已经有0人回复
-
广东石油化工学院2026年硕士研究生需要多名生物，制药工程，食品专业的调剂生
已经有0人回复
-
317分 一志愿江南大学 化学工程学硕 求调剂
已经有6人回复
-
化工申博
已经有3人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 基因克隆中酶切连接问题
已经有13人回复
- 做酶切连接后转化再提质粒，质粒明显变小，Why???
已经有24人回复
- 单酶切连接的问题
已经有4人回复
- DNA双酶切后在两端加adapter的连接问题
已经有7人回复
- 连接酶切问题
已经有10人回复
- 将质粒上紧挨着的两个酶切位点进行双酶切后连接外源基因片段，是不是不好连接？
已经有13人回复
- PCR ， 双酶切，连接问题
已经有17人回复
- 分子克隆连接问题！
已经有12人回复
- 双酶切连接表达载体，两个月都没做出来，问题到底出在哪里呢~？求指点
已经有52人回复
- 为什么我做的酶切连接总是不长斑呢？
已经有24人回复
- 【专题】分子克隆实验专题--（五）感受态细胞的选择与使用
已经有15人回复
- 【求助/交流】质粒双酶切连接问题
已经有7人回复
- 【求助/交流】关于酶切产物连接的一点问题
已经有13人回复
2楼2011-04-12 11:05:10
3楼2011-04-12 17:04:21
5楼2011-04-14 10:11:35
6楼2011-04-14 10:46:18
7楼2011-04-14 11:10:13
8楼2011-04-15 20:13:37
[font6非常感谢！很详细！ 9楼2011-05-09 16:31:40
10楼2011-07-20 18:04:12
11楼2011-08-17 21:28:39
12楼2011-12-22 09:41:56
13楼2012-12-04 16:37:05
14楼2012-12-14 16:21:36
15楼2013-05-30 15:05:03
16楼2013-08-19 19:04:51
简单回复
2011-04-14 08:01
回复
五星好评 
