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空谷幽风

金虫 (正式写手)

[资源] 【分享】分子克隆实验专题-（二）酶切连接要点探讨

分子克隆实验专题-（二）酶切连接要点探讨
声明：关于酶切连接的实验做法我在之前的帖子里已经非常详细的介绍了，原帖链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=2311683
我们在这里对相关问题进行探讨
1. 酶切
（1） PCR产物的酶切

①酶切位点两端要有适当的保护碱基。一般在设计引物的时候会在新添加的酶切位点前加4-5个碱基当做保护碱基，这种保护碱基的序列没有特殊的要求，不要添加完后使你的引物不能用就行了（好引物应该具备的条件大家应该都知道吧）
– NEB  http://www.nebchina.com/cn/tech/re/cleavage_olig.htm
– TaKaRa  PCR产物末端限制酶切位点的切段情况
②在保证不产生星号活性的情况下，适当延长酶切时间，但要注意核酸酶的污染。曾经用过fermentas的某种快切酶，切完后竟然会在酶切位点处多切掉1个碱基。

（2）质粒DNA的酶切
①不要选用临近的或交叉的酶切位点
如XbaI / BamHI/ SmaI
TCTAGA GGATCCCGGG
②小心容易甲基化的酶切位点，如XbaI。这种情况下我们一般会把质粒重新转一下甲基化修饰缺陷的感受态细胞，比如JM110(关于感受态细胞的选择我会专门开一个专题单独介绍)

2.影响酶切效果的因素
双酶切反应体系
• TaKaRa:
•    Double Digestion 时的Universal Buffer的使用表
• NEB:
• http://www.neb.com/nebecomm/DoubleDigestCalculator.asp
• MBI：
• http://www.fermentas.com/doubledigest/index.html
• 分步酶切顺序的选择：选择适当的酶切顺序(低盐 -----高盐）
甲基化位点的影响
• 设计方案时尽量避免使用
• JM110
• PCR 扩增后再切
质粒DNA的质量与定量
• 质量：抽提过程中杂质的残留
• 定量：分步酶切时,酶切足够的DNA,保证第二步回收到浓度较高的载体或片段
酶切不完全
• 公用buffer选择不当
• 质粒DNA量过多
• 酶的活性不高
酶切出的小片段回收效率低
• PCR扩增后再酶切
• 回收上柱时加终浓度为20%的异丙醇
• Glass beads (> 40 bp)

3.影响连接的因素
（1）片段的质量
片段回收时紫外线照射对克隆效率的影响

（2）摩尔比
In general, maximum cloning efficiency is achieved when using a 2:1 molar ratio of insert: vector.

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