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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于酶切产物连接的一点问题
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maxwell1988

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于酶切产物连接的一点问题 已有5人参与

最近在做重组基因的连接，但是连了好几次就是连不上。具体是这样的，希望高手帮忙答疑解惑下：
基因(~0.5kb)是单酶切，载体(~5kb)是双酶切，20μl体系，基因载体按摩尔比算的体积比：
基因     2μl
载体     9μl
buffer       2μl  
PDG         2μl   
T4连接酶 5μl
22℃，16h。
之后就是常规的转化了，菌落PCR，单酶切鉴定后发现条带的大小不对，宣告连接失败。
要命的是做了好几次，甚至有次还做了基因载体比例的梯度连接实验，结果还是以失败告终。我想知道问题可能出在了什么地方，有什么地方可以改进的，望各位大侠们不比吝赐教！！！
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perfectpig向前冲！别犹豫！
1楼 2010-11-19 10:05:44
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zhwenxing

木虫 (著名写手)

尛森蟲
★ ★ ★ ★ ★ ★
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lstt09nk(金币+5):全面，细心 2010-11-19 10:44:48
1、连接片段和载体的比例，不是按照ul来计算，是数量比，mol数！！！

2、500bp的片段连接载体是不成问题的。关键在于：切出来的末端是否和载体的缺刻正好相对？

3、不知道你的切点是平末端还是粘末端？前者是否需要脱磷处理，以提高连接效率？

4、不知用的是哪个公司的产品，检查是否过期等。连接酶5uL？？？这是带buffer吗？如果不是，是不是浓度太高了？甘油就能够完全抑制活性了。

5、22℃连接16h是否太长了？我经常用到的是4℃，2天；   16℃，30-50min；  22℃，2-5h……

6、建议按照说明书来做，做前仔细计算好体系，到底加多少！酶切的产物是否纯化了？纯化后溶解液是什么？是否检测浓度了？酶切后的载体是否存在自连？？

多数以反问的形式回答楼主，希望能有帮助。
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2楼2010-11-19 10:23:35
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skkyy88888

铜虫 (著名写手)
★
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基因(~0.5kb)是单酶切，载体(~5kb)是双酶切？？？

这个怎么连呢？先把酶切位点搞清楚再做吧。
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3楼2010-11-19 12:11:46
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zgb1982

木虫 (正式写手)
★
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首先，LZ说了是按mol数换算的体积，2楼没看清楚就说人家啊。
其他的倒都是问题，LZ考虑下吧，你都没说清楚
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4楼2010-11-19 13:22:15
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zhwenxing

木虫 (著名写手)

尛森蟲
★
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引用回帖:
Originally posted by zgb1982 at 2010-11-19 13:22:15:
首先，LZ说了是按mol数换算的体积，2楼没看清楚就说人家啊。
其他的倒都是问题，LZ考虑下吧，你都没说清楚

哦，偶买噶。sorry，的确没看清最后一句。谢谢提醒。觉得这个反应体系不太对头，混合后缓冲液的成分就有些不太对头的感觉。
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5楼2010-11-19 17:51:02
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maxwell1988

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by skkyy88888 at 2010-11-19 12:11:46:
基因(~0.5kb)是单酶切，载体(~5kb)是双酶切？？？

这个怎么连呢？先把酶切位点搞清楚再做吧。

额。。。用的是一种改造后的载体，载体是要双酶切，而基因是单酶切，为了防止载体自身环化，所以酶切后有一端是平末端，不过还是谢谢你的解答！
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6楼2010-11-20 21:50:42
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maxwell1988

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zgb1982 at 2010-11-19 13:22:15:
首先，LZ说了是按mol数换算的体积，2楼没看清楚就说人家啊。
其他的倒都是问题，LZ考虑下吧，你都没说清楚

谢谢解答，连接后转化，平板上长菌了，但是做了菌落PCR，单酶切后发现载体大小不对，这点让我比较郁闷，这种载体在设计时已经避免了载体自连了，那为什么平板上会有菌长出呢？
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7楼2010-11-20 21:53:46
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maxwell1988

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zhwenxing at 2010-11-19 10:23:35:
1、连接片段和载体的比例，不是按照ul来计算，是数量比，mol数！！！

2、500bp的片段连接载体是不成问题的。关键在于：切出来的末端是否和载体的缺刻正好相对？

3、不知道你的切点是平末端还是粘末端？前者 ...

谢谢了，您说的问题之前我大都做了分析了，酶没问题，因为实验室其他人用同样的体系连上了。。。
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8楼2010-11-20 21:56:43
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yzuxhq368

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
不知你酶切完了是切胶回收的还是纯化回收。前者连接效率低，后者有质粒切不完全，会有假阳性。可分几管分别酶切，然后合并回收。
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9楼2010-11-20 23:01:11
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skkyy88888

铜虫 (著名写手)
★
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引用回帖:
Originally posted by maxwell1988 at 2010-11-20 21:50:42:

额。。。用的是一种改造后的载体，载体是要双酶切，而基因是单酶切，为了防止载体自身环化，所以酶切后有一端是平末端，不过还是谢谢你的解答！

怪不得你连不上了，载体一端是平末端，但你的基因都是粘性末端，不可能连上的。你应该都是单酶切后，载体做去磷酸化处理来避免载体自连。
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10楼2010-11-21 08:43:42
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