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dhmdddd

木虫 (正式写手)

[求助] 单酶切,酶连之后验证问题

请教各位一个问题,因为智力上面没有合适的酶切位点,在质粒上面再加一个抗性基因的话需要设计一个单酶切酶连的位点,这个抗性基因很小,大概300左右bp,酶切验证的话跑胶的话会不是很清楚,请问可以做PCR验证吗?要是反接的话会不会也P出来目的基因?先谢过了!!
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上班族,学习ing……
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阿修罗Axuro

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
dhmdddd(金币+5): 知道了,十分感谢! 2011-07-11 11:14:20
lstt09nk(金币+2): 感谢交流,欢迎常来 2011-07-17 20:40:54
加抗性基因的话  一定要注意抗性基因的启动子一起加进去,这样不管是正接还是反接  ,都可以用。
300BP的酶切  质粒多加一点,其实是可以看出来的,用2%的胶,应该没问题。
PCR验证的话,反着接也是可以P出来的。
2楼2011-07-11 10:33:37
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ybs007

金虫 (小有名气)

★
adslye(金币+1): 鼓励新虫~~祝顺利! 2011-08-06 07:57:54
我也是新手,我弱弱的问一下,会出现反接的问题么?质粒是环状的哦。。。
平生我自知
3楼2011-07-16 20:34:47
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dhmdddd

木虫 (正式写手)

★ ★
adslye(金币+2): 鼓励交流~祝顺利! 2011-08-06 07:58:36
引用回帖:
Originally posted by ybs007 at 2011-07-16 20:34:47:
我也是新手,我弱弱的问一下,会出现反接的问题么?质粒是环状的哦。。。

你是单酶切的话,质粒线性化,就不是你说的环状的了,切了后两端都是相同的酶切位点,你要连的目的基因两端也是相同的酶切位点,所以你的目的基因有可能是正着,按着它编码转录翻译的顺序接上去,也有可能是反着接上去,反着话后面是不表达的,所以单酶切要验证正反接的!不知道我说明白没有……
上班族,学习ing……
4楼2011-07-17 12:11:02
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liuhedong1817

木虫 (正式写手)

hello

★
adslye(金币+1): 鼓励交流~祝顺利~ 2011-08-06 07:59:11
嗯,如果是双酶切的话,就不会出现反接这种情况了!
老婆的头像
5楼2011-07-17 15:35:11
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dhmdddd

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by liuhedong1817 at 2011-07-17 15:35:11:
嗯,如果是双酶切的话,就不会出现反接这种情况了!

一般我也不想用单切,但是没有合适的酶切位点,没办法……
上班族,学习ing……
6楼2011-07-17 16:21:36
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dhmdddd

木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 阿修罗Axuro at 2011-07-11 10:33:37:
加抗性基因的话  一定要注意抗性基因的启动子一起加进去,这样不管是正接还是反接  ,都可以用。
300BP的酶切  质粒多加一点,其实是可以看出来的,用2%的胶,应该没问题。
PCR验证的话,反着接也是可以P出来的。

话所上次问过之后就开始动手实验了,之前一直很好,后面T载体克隆后,单切连质粒的时候出现问题了,转化子老是不长,开始以为是没有连好,重复几次还是不行,后来又重新P了一下,然后连T载体后涂布了一个Kan的抗性板,结果没长,涂布Amp的平板长的很好,说明不是感受态的问题,按理说这个抗性加上起作用的话,连T载体也该长啊,这个会是什么原因呢?
上班族,学习ing……
7楼2011-08-05 21:30:13
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