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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助 双酶切验证阳性克隆的问题
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rainontime

新虫 (小有名气)

[求助] 求助 双酶切验证阳性克隆的问题

本人将某 2600bp的目的基因 和 pet28a载体 双酶切，切胶回收，T4连接酶4度过夜连接， 将10uL连接产物加到120uL感受态细胞中， 加入800uL无抗性培养基 摇菌50分钟， 涂平板10块，每块80uL, 过夜后，发现只长了一个菌落。。。挑取菌落培养，提取质粒，双酶切验证是否是阳性克隆，切成了两条片段，发现其中较短的那条片段比目的片段长！！！！！！！请问这是咋回事？谢谢！！！
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1楼 2011-08-01 16:05:57
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duckcat

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

rainontime(金币+1): 不错的 2011-08-01 18:10:16
1949stone(MolEPI+1): 不错 不错 2011-08-01 20:31:33
这是很正常的，一般酶切后的目的片段往往比pcr扩增得到的跑胶拖后，主要有以下几个物理因素造成：
1，因为载体属于比较大的分子了，质粒如果浓度较高的话，难免分子间的作用力较强，因为这种力的存在导致了目的片段跑胶速度较慢！
2, 可能切得时间比较长，导致许多分子杂质增多！
3，如果很靠后的话极有可能你的凝胶浓度不均匀……

暂时想到这么多！
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2楼2011-08-01 17:23:48
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rainontime

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by duckcat at 2011-08-01 17:23:48:
这是很正常的，一般酶切后的目的片段往往比pcr扩增得到的跑胶拖后，主要有以下几个物理因素造成：
1，因为载体属于比较大的分子了，质粒如果浓度较高的话，难免分子间的作用力较强，因为这种力的存在导致了目的片 ...

我用的是自己配的0.7%的胶，而且为了把条带拉开，跑了20分钟，因为片段比较大。。。。。。是不是这样也会导致位置偏移？谢谢！
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3楼2011-08-01 18:08:50
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d1emon

铜虫 (初入文坛)
★
1949stone(金币+1): 有一定道理 2011-08-01 20:31:53
跑的时间有点短，这也有可能造成你说的情况
，pcr验证加酶切验证即可确定
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4楼2011-08-01 19:17:22
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

1949stone(MolEPI+1): 来也 2011-08-01 20:32:03
1：连接体系不知道你选择的合适不，涂布了那么多板子怎么就长了一个单克隆，个人觉得你先从连接体系上着手，提高了连接的效率才能保证你做一次连接的成功率啊，你说是不？连接体系你先得定量看看你的载体和目的基因的量，如果量差不多的话，目的基因多加一些；当然了你要确定你的载体和基因酶切完全了；
2：至于验证嘛，很简单的，先把长出来的单克隆划到相同抗性的板子上，然后做一个PCR初步验证看看，如果能够P出来大小相同的一条带那很有可能就对了，然后再提取质粒进行酶切验证就OK了。
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5楼2011-08-01 19:59:14
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zgb1982

木虫 (正式写手)
只长一个斑，估计对的可能性也不大吧
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6楼2011-08-02 10:45:18
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rainontime

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 天使托 at 2011-08-01 19:59:14:
1：连接体系不知道你选择的合适不，涂布了那么多板子怎么就长了一个单克隆，个人觉得你先从连接体系上着手，提高了连接的效率才能保证你做一次连接的成功率啊，你说是不？连接体系你先得定量看看你的载体和目的基 ...

我在酶连之前跑过电泳了，质粒片段和目的基因片段亮度差不多。。。。。。。不知道怎么样才可以提高连接效率啊？
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7楼2011-08-02 11:49:05
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
引用回帖:
7楼: Originally posted by rainontime at 2011-08-02 11:49:05:
我在酶连之前跑过电泳了，质粒片段和目的基因片段亮度差不多。。。。。。。不知道怎么样才可以提高连接效率啊？

酶切连接之前要跑电泳，酶切纯化完之后也要跑电泳定量的，不然你怎么设置你的连接体系呢？随便加吗？
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8楼2011-08-02 13:44:54
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sunwei57

木虫 (小有名气)
载体自连,较小的片断根本不是你的外源片断,那是质粒的不同存在状态(超螺旋)
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9楼2012-03-17 12:26:54
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)
我今天也出现相同的情况，不知如何解决
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10楼2013-11-01 09:46:03
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