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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】目的基因与pPIC9K连接的问题！
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shihongling

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】目的基因与pPIC9K连接的问题！

我将与pUCm-T载体连接的目的基因与载体pPIC9K同时双酶切，酶切后电泳条带很清晰，割胶回收后将目的基因与9K载体连接16h,热激转化到DH5a感受态细胞中，重复了5次均未成功！求高手指点迷津啊！是不是pPIC9K没有切开啊？还是什么问题？我让师兄帮我做了一次，也没有成功！呜呜
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1楼 2011-04-11 16:52:42
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
你说的未成功具体是怎么个未成功法？转化后没有菌落？筛不到阳性克隆？
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2楼2011-04-11 17:06:49
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shihongling

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-04-11 17:06:49:
你说的未成功具体是怎么个未成功法？转化后没有菌落？筛不到阳性克隆？

几乎没有菌落，最多的时候长出3个菌落，做菌液PCR还是假阳性的……
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3楼2011-04-11 17:09:03
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
引用回帖:
Originally posted by shihongling at 2011-04-11 17:09:03:
几乎没有菌落，最多的时候长出3个菌落，做菌液PCR还是假阳性的……

有没有做阳性对照？就是把没有连接外源基因的载体直接转化，看看菌落长得怎么样。
如果连阳性对照都长不出来，那可能就是感受态细胞转化效率不高，或者干脆就已经没活力了，再有可能就是转化的方法不当啦。

看看实验室其他人转化其他质粒，他们实验都正常吗？
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4楼2011-04-11 17:41:28
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shihongling

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-04-11 17:41:28:
有没有做阳性对照？就是把没有连接外源基因的载体直接转化，看看菌落长得怎么样。
如果连阳性对照都长不出来，那可能就是感受态细胞转化效率不高，或者干脆就已经没活力了，再有可能就是转化的方法不当啦。

...

对照长的很好，感受态和转化都没有问题……
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5楼2011-04-11 20:44:56
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邓远洪dyh

新虫 (小有名气)
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西瓜(金币+4): good 2011-04-24 15:31:51
PPIC9K载体片段不要用泡胶回收，酶切后直接过回收柱就可以了，跑胶对载体的构型有很大影响。还有就是连接没有必要连接那么长的时间。转化后，涂板时不要离心收集菌体，离心对感受态细胞的伤害很大
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6楼2011-04-24 15:01:49
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starlinkong

金虫 (小有名气)
★
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我的也是，开始是不怎么长菌，长了之后又没有阳性。后来换酶切位点之后，长菌了，结果基本都是假阳性。自身引物P出来了，通用引物测序测不出来，郁闷啊...
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7楼2011-09-01 09:46:56
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starlinkong

金虫 (小有名气)
不知楼主问题解决否？
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8楼2011-09-01 09:48:14
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瓶儿花

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
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西瓜(金币+2): 鼓励交流 2011-09-01 18:09:37
很有可能是你的载体没有酶切完全，你要加个对照，以酶切后的载体直接转化感受态细胞作对照，看看抗性平板上长不长菌，如果长的很多就说明你载体没有酶切完全，每次连接转化的时候加这样一个对照，另外做个感受态的对照验证感受态细胞，结果出来后就很容易分析了。
祝你好运！
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9楼2011-09-01 10:11:23
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JINYC

铁杆木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
急求spss modeler14.0（14.1、14.2）破解版，可购买。
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10楼2015-03-21 18:55:10
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