应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 基因克隆中酶切连接问题
141/2返回列表12下一页
查看: 3584  |  回复: 13
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

zhjzhou

木虫 (著名写手)

[求助] 基因克隆中酶切连接问题

各位大侠好，我克隆一个2000bp左右的基因，一开始设计的引物没有加酶切位点，PCR产物直接连接到T-vector中，已经测序和我的目的基因完全吻合。于是又重新设计加上酶切位点的引物，从质粒上PCR，这样PCR产物纯化后可以直接连接到我要克隆的载体中，不需要酶切吧。我是这样做的，现在遇到问题了，我连接的产物转化老是长不出来。请各位指点下，我PCR产物和载体都需要酶切，再进行连接吗？我以前PCR产物没有酶切直接连接都可以的，现在不知道是怎么回事情了
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

核酸方面

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-02-20 12:36:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
zhjzhou(金币+3): ★★★很有帮助 2012-02-20 19:45:53
如果引物中有保护碱基，第二次PCR后可以不连T载体，直接酶切后连同样酶切的表达载体，再转化。
你不酶切是连不上的，长不出来正常，长出来也是携带空载体或杂菌。
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2012-02-20 17:00:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

merckten123

新虫 (初入文坛)
肯定需要酶切的啊，不酶切的话没有两者没有互补的粘性末端，应该不能连上的吧。。。。看你之前用的是T载体的，T载体是不需要的酶切的
赞一下 回复此楼
2楼2012-02-20 13:25:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhjzhou

木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lxj341401 at 2012-02-20 17:00:29:
如果引物中有保护碱基，第二次PCR后可以不连T载体，直接酶切后连同样酶切的表达载体，再转化。
你不酶切是连不上的，长不出来正常，长出来也是携带空载体或杂菌。

是的，长出来的，我检测了都没有，真是浪费了不少时间
赞一下 回复此楼
4楼2012-02-20 19:45:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

panda73

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
zhjzhou(金币+4): ★★★很有帮助 这个网站很好，谢谢！ 2012-02-21 10:35:43
内容已删除
赞一下 回复此楼
5楼2012-02-20 22:44:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

scienzyme

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
zhjzhou(金币+1): ★有帮助 2012-02-21 10:37:34
要切割了才会有粘性末端，这样才能连接，否则就没法连接了。
赞一下 回复此楼
6楼2012-02-21 08:13:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小猫三两只

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
zhjzhou(金币+1): ★有帮助 2012-02-21 10:37:45
不酶切的话肯定连不上，没有粘性末端与载体酶切后互补，你以前没有酶切的是不是连T载体啊，因为PCR后的产物带有A，因此可与T载体直接连接
赞一下 回复此楼
7楼2012-02-21 08:26:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhjzhou

木虫 (著名写手)
谢谢各位，是我自己疏忽了，是要酶切的。
赞一下 回复此楼
8楼2012-02-21 08:43:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yanbofeiyue

铜虫 (初入文坛)
内容已删除
回复此楼
justdoit!whateverotherssay!
9楼2012-02-21 09:22:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

whb21

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
zhjzhou(金币+1): 2012-02-21 10:37:53
你实验流程有问题，PCR产物（含有限制性酶切位点）和质粒载体应该分别用同样的限制性内切酶处理，在分别回收，然后再进行连接。建议你看看分子克隆表达这方面的文章。
赞一下 回复此楼
10楼2012-02-21 09:35:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 zhjzhou 的主题更新
141/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 今天系统多次维护，明天很可能放榜！ +5 zju2000 2026-08-16 5/250 2026-08-16 23:23 by Haru815
[基金申请] 欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律 +32 医学老男孩 2026-08-13 74/3700 2026-08-16 21:05 by 医学老男孩
[基金申请] 时间戳又变了8-15 +13 archvillain 2026-08-15 25/1250 2026-08-16 20:13 by zhaosm1982
[基金申请] 快农历七夕节了，轻松一下，男人悄悄话，女施主请不要进来。 +3 Tide man 2026-08-14 3/150 2026-08-16 17:47 by jurkat.1640
[基金申请] 哪位老哥知道今年的国自然具体哪一天放榜？ +9 Ldrop2023 2026-08-13 9/450 2026-08-16 13:24 by wukun_007
[基金申请] 我的国基提前知道中了，可是同事的操作让我实在接受不了，怎么会有这样的人 +11 家与远方 2026-08-10 16/800 2026-08-16 10:28 by ray43
[基金申请] 有时候，自然基金真的不能太认真 （我的申报经验） +10 majunge000 2026-08-11 12/600 2026-08-16 08:18 by xli1984
[精细化工] 招聘 金属平磨液，抛光液研发工程师 +3 小天0311 2026-08-14 3/150 2026-08-16 07:31 by H9PLUS
[基金申请] filecode +8 cratir 2026-08-14 12/600 2026-08-15 18:08 by zyfgau
[基金申请] 小木虫上这么多卖论文的，真有人买论文么？感觉没必要啊 +12 Tide man 2026-08-10 13/650 2026-08-15 16:34 by 氺木
[基金申请] 是这周出结果还是下周出结果？ +4 yuleib84 2026-08-11 4/200 2026-08-14 23:05 by lfy8008
[硕博家园] 读博的好处 +4 lnee 2026-08-11 4/200 2026-08-14 10:20 by ahsoarli
[基金申请] filecode +15 documentary 2026-08-10 17/850 2026-08-14 10:08 by kissu88
[基金申请] FileCode能看出啥？ +10 要乐观耀哥 2026-08-10 32/1600 2026-08-14 09:37 by 要乐观耀哥
[基金申请] 静等基金结果 +8 gjjjzhong 2026-08-10 21/1050 2026-08-13 17:56 by 且听虎啸
[基金申请] 不应该看fileCode +7 且听虎啸 2026-08-12 9/450 2026-08-13 14:27 by flydreamws
[基金申请] Filecode 又变了，巨变 +3 WH3796 2026-08-12 4/200 2026-08-13 14:13 by 小木虫6752397
[基金申请] 分享一下我之前已中青C的计划书的filecode +4 布布和一二 2026-08-11 5/250 2026-08-13 12:56 by cratir
[基金申请] 结合人工智能，周易传统文化，filecode打分制来了，3分以上希望很大。 +3 Tide man 2026-08-12 4/200 2026-08-13 08:35 by ZJTJZ
[基金申请] 确定了，国自然21号放榜 +6 布布和一二 2026-08-10 7/350 2026-08-10 19:15 by 2000zf36392
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭