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wudiguigui99

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】克隆载体的制备 连接问题 已有3人参与

制备克隆载体过程中连接反应是PCR得到的目的基因产物与酶切的质粒载体进行反应
问题是
PCR产物是平末端,正常酶切载体得到的是粘性末端,两者具体是什么原理或者机制连接上的啊 ,连接体系中也没有dNTP啊?
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

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scelab(金币+1):欢迎多来交流!:tiger06: 2010-11-17 23:10:13
PCR引物上引入合适酶切位点,所以PCR产物与质粒分别酶切,然后纯化后连接,完成PCR产物亚克隆。
2楼2010-11-16 22:26:44
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wudiguigui99

银虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 克隆大虾 at 2010-11-16 22:26:44:
PCR引物上引入合适酶切位点,所以PCR产物与质粒分别酶切,然后纯化后连接,完成PCR产物亚克隆。

那其实就是 等同于粘性末端与粘性末端的连接,是吧?>
3楼2010-11-17 18:34:36
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ben1147

木虫 (正式写手)

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scelab(金币+1):欢迎多来交流!:tiger06: 2010-11-17 23:10:21
引用回帖:
Originally posted by wudiguigui99 at 2010-11-16 21:16:48:
制备克隆载体过程中连接反应是PCR得到的目的基因产物与酶切的质粒载体进行反应
问题是
PCR产物是平末端,正常酶切载体得到的是粘性末端,两者具体是什么原理或者机制连接上的啊 ,连接体系中也没有dNTP啊?

要么粘末端和粘末端连(载体和PCR片段都酶切,或者3'端有A的Taq酶PCR片段和T载体)
要么平末端和平末端连

没有一平一粘连的吧。。。。。。。。
4楼2010-11-17 19:27:58
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by wudiguigui99 at 2010-11-17 11:34:36:



那其实就是 等同于粘性末端与粘性末端的连接,是吧?>

恭喜你,回答灰常正确....
5楼2010-11-17 19:59:16
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