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beisimai895木虫 (小有名气)
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[交流]
【求助/交流】TA克隆为什么会长出蓝斑 已有4人参与
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| 请教一个问题，TA克隆完蓝白筛，会长出蓝斑吗？T载体不是俩头都是A尾吗？应该不会自连吧，还有，T载体可做去磷酸化吗？ |
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 实验方法 |
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2楼2010-07-15 10:48:34
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4楼2010-07-15 11:44:01
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1949stone(金币+2):谢谢交流 2010-07-15 12:55:43
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一种情况是单链突出的T容易降解，尤其T载体上是3'的突出末端，在没有分装，反复冻融的情况下容易发生。大家平时都认为出现蓝斑是因为这种载体自连，但是这种情况的发生要求两端T都降解才行，实际情况中只占很少一部分。 比较多的情况是买来的载体里面本身就有环状质粒，或者线状质粒末端本身就没有T而发生的自连，这两种都是T载体质量的问题 如果你看过T载体制备的过程的话，应该能理解这两种情况的出现。 T载体也是用一般的克隆载体制备的，先用平末端的酶切（常见的有Sma I或者Eco RV），然后再利用Taq的特性给两条链平末端的3'端加上T。大家都知道Taq酶在dNTP存在的情况下会给3'端加A，这个反应不需要模板。实际上Taq酶并不是只能加A，而是在四种核苷酸都存在的情况下倾向于加A。事实上如果体系里面只有dTTP的话，Taq酶也能加T。 因此T载体制备主要就是两个步骤，酶切和加T。 如果酶切不完全，体系里残留有没切开的超螺旋质粒，产物又没有切胶纯化的话，残留的野生质粒就会留在最终的产品里，转化到感受态里，形成蓝斑 如果加T不完全，就会有线性平末端、没有T的质粒残留，就会在连接体系中发生自连而产生蓝斑 如果用的是promega、takara之类大公司的T载体，这种情况还少一点。如果是国内公司的产品，质量真的不敢保证。 当然T载体的制备也有另一种方法（连接接头，Xcm I酶切）。但是根据现在的T载体T两端紧接的就是MCS来看，应该还是上面说的这种方法。 其实知道了方法，自己就可以做T载体，用不同的克隆载体做，pUC系列，pBluescript系列等等，甚至可以把表达载体做成T载体。我们实验室就是用的自己做的T载体，可以根据目的片段内部的酶切位点是否合适来选择不同的载体，比只有买来的一种载体方便多了。 |
5楼2010-07-15 12:14:06
