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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】求助TA克隆问题
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sdluqun

铁杆木虫 (著名写手)

板砖队长

[交流] 【求助/交流】求助TA克隆问题 已有9人参与

前天做的目的片段PCR并且胶回收，经琼脂糖检测，4微升上样量，条带亮度大约D2000 Marker 中的750条带的两倍，即含量约为300ng/ul。当天晚上做上连接，用的是promega的T载体：5ul  2*buffer;   1ul T4连接酶;    1ul（50ng/ul） pGEM-T easy 载体;    3/2/1ul 回收的目的片段;   ddH2O补齐至10ul体系。
前天晚上接菌DH5α，昨天早上转接，之后氯化钙法制备了感受态，放置4小时，转化，摇菌，涂板。平板翻过来的时间为20：30，今天早上来实验室看看，阳性对照和样品都是一片空白，郁闷，
恳求高手指点！！！
PS：我的目的基因在1400bp左右，是不是片段偏大不好连呢？

[ Last edited by sdluqun on 2010-6-10 at 19:44 ]
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尔非我焉知我悲喜
1楼 2010-06-09 11:09:43
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)

合伙创业版兼职版主

优秀版主
sdluqun(金币+2):谢谢您的宝贵意见！ 2010-06-09 11:22:46
感受态失败，先解决了这个问题才能继续说别的，用定量的环形质粒检测一下，1ug质粒至少要达到6次方的转化效率才可以勉强应付T载体
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2楼2010-06-09 11:19:46
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liyong1981

金虫 (正式写手)
competent cell 效率不高吧～
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3楼2010-06-09 11:42:12
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ben1147

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
amisking(金币+3):好建议！ 2010-06-09 12:30:31
新制备的感受态用之前一定要检验
一是不转东西直接涂抗性板，看看有没有污染
二是转定量的超螺旋质粒，计算转化效率。一般氯化钙做的感受态在(10^6~10^7 )cfu/ug DNA 比较正常，太低的话转连接产物很容易得不到阳性克隆

要求高的话可以用一些改进的制备液（MnCl2，KCl，CaCl2等盐组成），做得好的话能到10^8

[ Last edited by ben1147 on 2010-6-9 at 13:13 ]
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4楼2010-06-09 11:50:27
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fywjp

木虫 (正式写手)
★
amisking(金币+1):建议不错！ 2010-06-09 12:30:44
楼上说的都有可能，建议楼主每一步都做个对照，查找原因，克隆本身步骤就多，不做对照出了问题不好说啊，弄不清请哪个环节出问题的。
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5楼2010-06-09 12:05:10
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墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫
sdluqun(金币+2):我用的是普通的Taq，没用高保真酶，应该会有A尾巴吧？还是要谢谢您的建议 2010-06-09 14:49:10
感受态要先验证。    楼主扩增片段是用pfu吧，没加polyA?
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仕不可不弘毅，任重而道远
6楼2010-06-09 12:25:21
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悬崖上的牛仔

铜虫 (小有名气)
sdluqun(金币+1): 2010-06-09 14:49:23
sdluqun(金币+1): 2010-06-09 14:49:32
加的目的片段的量可以再改进一下
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生如夏花
7楼2010-06-09 12:59:10
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bujunyang

木虫 (正式写手)

卓尔不群
sdluqun(金币+1):以为之前做的还好，问了下周围实验室都自己做的说效率还蛮高，所以就没买... 2010-06-09 14:50:20
我认为实验室就不应该在做感受态细胞这种事情上浪费时间。
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来是偶然，去是必然。
8楼2010-06-09 13:05:12
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ben1147

木虫 (正式写手)
★
lstt09nk(金币+1):确实如此~~ 2010-06-09 16:05:41
sdluqun(金币+1): 2010-06-09 16:43:42
引用回帖:
Originally posted by bujunyang at 2010-06-09 13:05:12:
我认为实验室就不应该在做感受态细胞这种事情上浪费时间。

问题是不是所有的菌株都是商业化的
常见的工程菌买感受态可以，一些特殊用途的菌，或是自己实验室构建的菌还得自己做
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9楼2010-06-09 15:53:43
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zhangjh069975

银虫 (初入文坛)
sdluqun(金币+1): 2010-06-09 23:01:25
感受态的问题
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心若在，梦就在！
10楼2010-06-09 19:35:15
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