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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】急！克隆快做了一个月了，就是做不出来
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nutplay

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】急！克隆快做了一个月了，就是做不出来 已有20人参与

TA 克隆
载体：pMD 18-T(Takara)
感受态：DH5a (天根)
实验流程是基本按照分子克隆上说的
PCR产物做了纯化，由于浓度比较低，所以
载体：0.5ul
PCR产物：4.5ul
Solution I: 5ul
14-16°连接过夜
转化用100ul的感受态细胞
热激什么的都没有问题，复苏后浓缩成100ul全部涂板，但是就是不长东西。做了阳性对照，也没长。好奇怪啊，不知道是哪里出了问题。
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1楼 2010-12-28 13:35:28
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★ ★ ★
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amisking(金币+2):鼓励 2010-12-28 19:42:26
先转个空质粒看看感受态是否有问题先。
如果感受态没问题，阳性对照都不长，应该要考虑盒子的问题了。
再就是你的片段多大？超过3K，pMD18-T连起来就有点难度了。

[ Last edited by susizheng on 2010-12-28 at 14:09 ]
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Thank-you，so-blue.
2楼2010-12-28 14:08:49
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nutplay

新虫 (初入文坛)
片段1700多bp，正常大小，做了阳性对照的，还是没有长，换过好几个感受态了，以前用过人家做过能做出来的感受态也不长，崩溃啊~~~
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3楼2010-12-28 14:18:43
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lhwei1987

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★
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rainwander(金币+1):鼓励积极参与~~~ 2011-01-01 00:57:10
连接时间可以加长试试，我上次一个2000的连接20小时才筛出来
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4楼2010-12-28 15:26:09
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
★ ★ ★ ★
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dhd997(金币+3):good 2010-12-29 17:06:49
建议：
1:重新做感受态细胞，细胞并不是浓度越大越好，我们一般是50-60ul，再转化；
2：重新连接，把连接体系可以稍微变一下，DNA量可以稍微加大一些，一般如果没有连上的话，细胞再好，也不会长的，不知道你的质粒是什么抗性，当然了也可以把抗生素浓度降低一些！
3：连接时间可以长一些，一般都是过夜连接，记得我上次连接几个基因，连了7，8个小时吧，转化之后涂布就长了几个，可是验证是正确的，后来连接一个基因，连接了15个小时吧，然后涂布，长的很多，挑了几个验证，都是正确的！
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
5楼2010-12-28 15:30:25
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知秋

至尊木虫 (著名写手)
感受态的问题吧
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6楼2010-12-28 15:48:16
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poog502

木虫 (正式写手)
★ ★
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rainwander(金币+1):鼓励积极参与~~~ 2010-12-29 17:11:57
引用回帖:
Originally posted by nutplay at 2010-12-28 13:35:28:
TA 克隆
载体：pMD 18-T(Takara)
感受态：DH5a (天根)
实验流程是基本按照分子克隆上说的
PCR产物做了纯化，由于浓度比较低，所以
载体：0.5ul
PCR产物：4.5ul
Solution I: 5ul
14-16°连接过夜
转化用1 ...

实话说pMD 18-T的载体空质粒或者连接其他片段、小片段的几率很高，我的效率是100个克隆中有3-5个阳性克隆。你这么着急的话换成promega的pGEM-T easy vector这个效率才是号称的98%以上，这么说我就从没挑到过假阳性的，⊙﹏⊙b汗，说真的，缺点就是贵、合适的酶切位点少
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7楼2010-12-28 15:53:00
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poog502

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by poog502 at 2010-12-28 15:53:00:


实话说pMD 18-T的载体空质粒或者连接其他片段、小片段的几率很高，我的效率是100个克隆中有3-5个阳性克隆。你这么着急的话换成promega的pGEM-T easy vector这个效率才是号称的98%以上，这么说我就从没挑到过假 ...

补充一点：这个是4℃连接过夜>12h
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8楼2010-12-28 15:53:44
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wzwhq

铁虫 (小有名气)
★ ★
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rainwander(金币+1):鼓励积极参与~~~ 2011-01-01 00:57:27
有可能是氨苄板的问题，你重新配一下氨苄板试试。
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9楼2010-12-29 16:47:25
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geniusma

木虫 (正式写手)
★ ★
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dhd997(金币+1):鼓励交流 2010-12-29 17:07:29
悲剧啊，ta克隆都做不出，不可能不长吧，ta最容易长的一板都是，当然很多是阴性的，同意ls，要么是感受态，要么是amp板的问题，全部重配用新的，再来一次
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10楼2010-12-29 17:01:47
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