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nutplay

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 21.1
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在线: 6.7小时
虫号: 942044
注册: 2010-01-13

[交流] 【求助/交流】急！克隆快做了一个月了，就是做不出来已有20人参与

TA 克隆
载体：pMD 18-T(Takara)
感受态：DH5a (天根)
实验流程是基本按照分子克隆上说的
PCR产物做了纯化，由于浓度比较低，所以
载体：0.5ul
PCR产物：4.5ul
Solution I: 5ul
14-16°连接过夜
转化用100ul的感受态细胞
热激什么的都没有问题，复苏后浓缩成100ul全部涂板，但是就是不长东西。做了阳性对照，也没长。好奇怪啊，不知道是哪里出了问题。

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1楼 2010-12-28 13:35:28

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

poog502

木虫 (正式写手)

应助: 9 (幼儿园)
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虫号: 723755
注册: 2009-03-16
专业: 果树学

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
rainwander(金币+1):鼓励积极参与~~~ 2010-12-29 17:11:57

引用回帖:

Originally posted by nutplay at 2010-12-28 13:35:28:
TA 克隆
载体：pMD 18-T(Takara)
感受态：DH5a (天根)
实验流程是基本按照分子克隆上说的
PCR产物做了纯化，由于浓度比较低，所以
载体：0.5ul
PCR产物：4.5ul
Solution I: 5ul
14-16°连接过夜
转化用1 ...

实话说pMD 18-T的载体空质粒或者连接其他片段、小片段的几率很高，我的效率是100个克隆中有3-5个阳性克隆。你这么着急的话换成promega的pGEM-T easy vector这个效率才是号称的98%以上，这么说我就从没挑到过假阳性的，⊙﹏⊙b汗，说真的，缺点就是贵、合适的酶切位点少