应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】求助TA克隆问题
51/1返回列表
查看: 2144  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

sdluqun

铁杆木虫 (著名写手)

板砖队长

[交流] 【求助/交流】求助TA克隆问题 已有9人参与

前天做的目的片段PCR并且胶回收，经琼脂糖检测，4微升上样量，条带亮度大约D2000 Marker 中的750条带的两倍，即含量约为300ng/ul。当天晚上做上连接，用的是promega的T载体：5ul  2*buffer;   1ul T4连接酶;    1ul（50ng/ul） pGEM-T easy 载体;    3/2/1ul 回收的目的片段;   ddH2O补齐至10ul体系。
前天晚上接菌DH5α，昨天早上转接，之后氯化钙法制备了感受态，放置4小时，转化，摇菌，涂板。平板翻过来的时间为20：30，今天早上来实验室看看，阳性对照和样品都是一片空白，郁闷，
恳求高手指点！！！
PS：我的目的基因在1400bp左右，是不是片段偏大不好连呢？

[ Last edited by sdluqun on 2010-6-10 at 19:44 ]
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

科研

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
尔非我焉知我悲喜
1楼 2010-06-09 11:09:43
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bujunyang

木虫 (正式写手)

卓尔不群
sdluqun(金币+1):以为之前做的还好，问了下周围实验室都自己做的说效率还蛮高，所以就没买... 2010-06-09 14:50:20
我认为实验室就不应该在做感受态细胞这种事情上浪费时间。
赞一下 回复此楼
来是偶然，去是必然。
8楼2010-06-09 13:05:12
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 11 个回答

silicare

荣誉版主 (文坛精英)

合伙创业版兼职版主

优秀版主
sdluqun(金币+2):谢谢您的宝贵意见！ 2010-06-09 11:22:46
感受态失败，先解决了这个问题才能继续说别的，用定量的环形质粒检测一下，1ug质粒至少要达到6次方的转化效率才可以勉强应付T载体
赞一下 回复此楼
2楼2010-06-09 11:19:46
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liyong1981

金虫 (正式写手)
competent cell 效率不高吧～
赞一下 回复此楼
3楼2010-06-09 11:42:12
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ben1147

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
amisking(金币+3):好建议！ 2010-06-09 12:30:31
新制备的感受态用之前一定要检验
一是不转东西直接涂抗性板，看看有没有污染
二是转定量的超螺旋质粒，计算转化效率。一般氯化钙做的感受态在(10^6~10^7 )cfu/ug DNA 比较正常，太低的话转连接产物很容易得不到阳性克隆

要求高的话可以用一些改进的制备液（MnCl2，KCl，CaCl2等盐组成），做得好的话能到10^8

[ Last edited by ben1147 on 2010-6-9 at 13:13 ]
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2010-06-09 11:50:27
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 11 个回答
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 Qj98d49dHFb9 2026-08-25 4/200 2026-08-26 03:08 by cNXvBfCpiZOM
[基金申请] 2026年8月25日国自然放榜前突然收到列入评审专家邮件，有关系吗？ +17 木水思豆 2026-08-25 20/1000 2026-08-26 01:26 by chengyan1220
[基金申请] 今天务委会开完了，明天出结果吗 +18 angus9576 2026-08-25 22/1100 2026-08-26 00:41 by merchancy
[基金申请] 明天应该可查了！？ +6 chengyan1220 2026-08-23 6/300 2026-08-25 19:45 by zfd97
[基金申请] 有没有大神帮我看看基金代码 28+4 1234567wang 2026-08-24 10/500 2026-08-25 19:15 by lfy8008
[基金申请] 某些机构，以效率低为荣，以效率低作为存在感 +9 yuleib84 2026-08-25 10/500 2026-08-25 17:14 by alexon
[基金申请] 2026国自然函评费到账 +20 羊腰板 2026-08-21 23/1150 2026-08-25 16:34 by zsna
[基金申请] 今日不放榜？网传国自然预计 8 月 27 日可查结果 +17 医学老男孩 2026-08-20 22/1100 2026-08-25 15:36 by 医学老男孩
[基金申请] 如果此刻你正在为国基感到焦虑，不妨来听听这首《基金之外》 +8 scalable 2026-08-24 8/400 2026-08-25 12:52 by jnhyjjm
[基金申请] 人气不行了 +11 fansofjerry 2026-08-21 11/550 2026-08-25 11:04 by 孤独的英雄6
[教师之家] 导师吐槽：我怎么摊上了这么个极品研究生！ +3 苏东坡二世 2026-08-23 3/150 2026-08-25 10:35 by shisan1313
[基金申请] 2026年的国家社科基金项目通讯评审的新规则与新动向、新挑战 +5 process2012 2026-08-23 7/350 2026-08-25 09:42 by huixian257
[基金申请] 今天基金会出结果吗？20260819 +17 kkkl_v 2026-08-19 18/900 2026-08-25 09:41 by windflowerwy
[基金申请] 能否退出参与的面上项目解除限项 +21 koalala 2026-08-24 24/1200 2026-08-24 19:25 by 家与远方
[基金申请] filecode，4个jtjc了 +14 ziyangfang 2026-08-19 17/850 2026-08-24 18:37 by 哈哈蛤？
[教师之家] 跳槽后在研项目怎么办？ +5 简单化xn 2026-08-22 10/500 2026-08-23 12:38 by 简单化xn
[基金申请] 时间戳今天，20号变了 +5 archvillain 2026-08-20 5/250 2026-08-22 06:12 by hui_daxiao
[基金申请] 看来今天不会放榜了？ +8 chengyan1220 2026-08-21 11/550 2026-08-21 17:52 by dcqxinyang
[基金申请] 今天放榜没戏了吧 +9 yuleib84 2026-08-19 11/550 2026-08-21 10:06 by gltch
[基金申请] 基金啊基金 +4 longfie172 2026-08-20 4/200 2026-08-21 08:58 by mark mao
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭