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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】克隆Amp/Kan选择以及蓝白筛选
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pamuk

铁虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】克隆Amp/Kan选择以及蓝白筛选 已有3人参与

关于克隆有几个问题盼高人解答：
1.正常来说AMP和卡那霉素做平板都可以，但是我使用的克隆试剂盒上特别提到，a.如果是最大化转导；b.克隆大片段PCR产物（>1000bp）c.使用卡那霉素筛选；满足这三个条件就用regular protocol

如果是快速转导就用rapid protocol

当然我希望的是最大化转导，因为是做的是环境基因组，而且PCR产物也大于1kb。之前都是觉得用AMP是没有任何问题的，但是这里这样特别提醒是不是意味着我只能用卡那霉素筛选啊？

2.蓝白斑筛选一般需要3个试剂：Amp、X-gal、IPTG，但是我的试剂盒上提到不要使用IPTG？这是什么道理。。。
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1楼 2010-07-31 22:05:48
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louli

铜虫 (小有名气)
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看天(金币+1):鼓励回答 2010-07-31 22:23:23
IPTG不是诱导蛋白的吗，你是转化之后跑蛋白电泳吗，至于是用氨苄还是卡那霉素你做个对照就行了，它的选择得看载体图谱。
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2楼2010-07-31 22:18:51
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pamuk

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by louli at 2010-07-31 22:18:51:
IPTG不是诱导蛋白的吗，你是转化之后跑蛋白电泳吗，至于是用氨苄还是卡那霉素你做个对照就行了，它的选择得看载体图谱。

是啊，就是利用诱导做蓝白斑筛选，以前看Takara的连接试剂盒就是这么做的，换了个克隆体系，说明书也是英文的，特别提到这点，很多地方与之前的做法都不一样，不理解。。。
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3楼2010-07-31 22:21:20
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louli

铜虫 (小有名气)
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没有关系啊 我酶切之后连接就用宝生物的T4连接酶连接，就直接转化啦 也不用什么试剂盒啊
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4楼2010-07-31 22:24:57
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pamuk

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by louli at 2010-07-31 22:18:51:
IPTG不是诱导蛋白的吗，你是转化之后跑蛋白电泳吗，至于是用氨苄还是卡那霉素你做个对照就行了，它的选择得看载体图谱。

不是蛋白电泳，就是转化后筛选克隆，菌落PCR
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5楼2010-07-31 22:25:45
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louli

铜虫 (小有名气)
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Originally posted by pamuk at 2010-07-31 22:25:45:

不是蛋白电泳，就是转化后筛选克隆，菌落PCR

哦 那你是用T载体连目的片段吗 转化之后质粒PCR 鉴定
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6楼2010-07-31 22:43:12
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pamuk

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by louli at 2010-07-31 22:43:12:



哦 那你是用T载体连目的片段吗 转化之后质粒PCR 鉴定

是啊，是啊，其实是很常规的做法啊，就是这个克隆体系说明书中有上述不明白问题。。。
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7楼2010-07-31 22:45:48
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
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你用的什么细胞？什么载体？X-gal是不是也只是在做对照的时候才用得上啊？
我以前用的topo载体，top-10细胞做克隆，是不需要蓝白筛选的，所以IPTG、X-gal都用不上，利用的连接原理也和使用T4连接酶的那种不一样
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8楼2010-07-31 22:53:35
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louli

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by pamuk at 2010-07-31 22:45:48:

是啊，是啊，其实是很常规的做法啊，就是这个克隆体系说明书中有上述不明白问题。。。

我们没有那么多注意的 一直就用氨苄抗性呢 没事，能张，我们一直这么克隆 呵呵别担心
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9楼2010-07-31 22:57:17
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pamuk

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-07-31 22:53:35:
你用的什么细胞？什么载体？X-gal是不是也只是在做对照的时候才用得上啊？
我以前用的topo载体，top-10细胞做克隆，是不需要蓝白筛选的，所以IPTG、X-gal都用不上，利用的连接原理也和使用T4连接酶的那种不一样

用的是DH5a感受态，pCR2.1载体（Invitrogen）载体，连接原理是与T4不一样，哦，看来你使用的是跟我的很像啊，盼你详细解答啊。。。
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10楼2010-07-31 22:59:20
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