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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » gel-shift蛋白结合DNA的问题
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yuxia82012

木虫 (著名写手)

[求助] gel-shift蛋白结合DNA的问题

最近做gelshift研究蛋白与DNA的结合，在用不同量得蛋白与DNA反应后，跑5%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，扫图见下，这个结果看出来是结合了，但是感觉有点不正常，主要是跑完后，在同样的曝光度下，蛋白量加的多的泳道DNA信号很弱，加大曝光度后可以明显看见上面有结合，不知道这是不是有问题，怎么证明这个蛋白是特异结合这段DNA而不是随便什么DNA都能结合呢？
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在等待中涅槃重生
1楼 2011-06-02 21:24:04
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yuxia82012

木虫 (著名写手)
自己顶一下，别沉了
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在等待中涅槃重生
2楼2011-06-03 09:43:16
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爱mm

木虫 (著名写手)
我想请教一下，你的蛋白和DNA是怎么结合的？氨基羧基，还是适体结合？两者结合后，结合了蛋白的DNA跑的慢，而没有结合的跑的快，是这个原理吗？
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木虫给力！
3楼2011-06-23 09:05:30
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yuxia82012

木虫 (著名写手)
★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励交流 2011-06-23 14:40:19
引用回帖:
Originally posted by 爱mm at 2011-06-23 09:05:30:
我想请教一下，你的蛋白和DNA是怎么结合的？氨基羧基，还是适体结合？两者结合后，结合了蛋白的DNA跑的慢，而没有结合的跑的快，是这个原理吗？

应该是适体结合，结合后的复合体跑得慢，就是这个原理
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在等待中涅槃重生
4楼2011-06-23 10:40:16
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wuzuobin125

铜虫 (小有名气)
不懂得这方面的知识，楼主能把这种实验的目的和用途说一说嘛，实在是想多学习一点东西，
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5楼2011-06-23 13:42:35
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yuxia82012

木虫 (著名写手)
我做的是一个调控基因机理的研究，也就是这个调控蛋白通过结合到特异基因的启动子区域来调控下游基因的表达，这个实验就是测试这个调控蛋白是否真的和预测的启动子基因序列有结合作用的
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在等待中涅槃重生
6楼2011-06-23 15:13:29
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zhcosa

金虫 (小有名气)
加一段不相干的DNA做阴性对照行吗？如果只能楼主的目标DNA结合，而不结合其他DNA，那就说明特异性啦
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7楼2011-06-23 16:09:06
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yuxia82012

木虫 (著名写手)
首先看有没有结合，然后看是否特异，我一般是加不标记的这段DNA进行竞争，再做一个不相干DNA竞争，这样就能看出来是否特异了
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在等待中涅槃重生
8楼2011-06-23 19:16:06
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lilirong2009

铜虫 (小有名气)
普遍性结合
蛋白质与DNA的主链骨架接触，多数碱性或中性侧链与
磷酸二酯键的氧接触，短的极性侧链和-NH与DNA骨架接触提
供更多的立体接触特异性。
特异性结合
蛋白质识别DNA的特定序列，与碱基直接接触：直接氢
键、水分子介导氢键、疏水接触，多数发生在大沟内(碱基顺序
表面)。
这样特异结合的文章是有的，我在电脑里面找不到放哪里了，你自己找找。
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9楼2011-06-25 14:42:12
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13808906306

金虫 (正式写手)
楼主，问个问题你制非变性聚丙烯酰胺凝胶时加甘油了吗？配方能否透露一下，最近做的emsa老不出现条带，有点抓狂
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10楼2012-09-23 00:24:52
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