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yuxia82012

木虫 (著名写手)

[求助] 板上有做过Gel-shift的朋友没?

最近准备做这个,主要是检验蛋白和DNA的结合作用,我是把可能结合的DNA合成为5‘-Biotin的引物,表达蛋白反应后再跑聚丙烯酰胺的非变性胶,后面用照胶仪检测荧光,由于是第一次做,也没什么经验,不知道各位有什么建议以及注意事项没?
还有一点不确定的是这个蛋白结合DNA位点是结合双链的还是单链的,如果是双链的,我能不能合成一对互补引物通过退火是她们变成双链再反应?
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在等待中涅槃重生
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elvias

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
yuxia82012(金币+1): 非常好的建议 2011-04-20 22:14:55
西瓜(金币+2): 鼓励 2011-04-20 23:07:33
西瓜(金币+3, EPI+1): 热心,专业的高手 2011-04-20 23:08:49
1.标记的探针与结合蛋白需要在室温下结合一段时间,一般为10-20分钟。
2.如果是检验可能的结合还需要做探针的冷竞争反应。
3.注意下电泳时间和转膜的时间,如果你是用干胶仪的话就需要注意电泳的时间,一般为10v/cm.。
4.结合实验需要用双链的探针,可以使用退火的双链探针。
2楼2011-04-20 21:45:25
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yuxia82012

木虫 (著名写手)

我还有几个问题,就是我能不能直接跑完胶不转膜检测,楼上说的干胶仪是什么东东,不转膜的话一定得用吗?
我的DNA链长只有20多个碱基,一般跑多大浓度的胶合适?
谢谢了
在等待中涅槃重生
3楼2011-04-20 22:19:07
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elvias

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励热心朋友 2011-04-20 23:08:13
1.我用biotin的时候都是转膜去显影,以前试过直接显效果不太好,不过你可以试试,用同位素时我都是用干胶仪干胶后显影,因为同位素灵敏度较高。
2.4%-6%的都可以,推荐用6%,胶要结实点便于操作,你可以在空泳道加上一点有颜色的loading,一般跑到距下沿1/3处就差不多了
4楼2011-04-20 22:28:34
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yuxia82012

木虫 (著名写手)

显影的话就像杂交那样子吗?是不是还要定对应的抗体?还是直接紫外激发后检测?
另外这个灵敏度高不高?直接照时就用照胶仪就可以看见吗,还是得有具体的波长来照射?问题有点多,呵呵,麻烦了
在等待中涅槃重生
5楼2011-04-20 22:33:23
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elvias

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

类似杂交不用抗体,需要显色液辅助。
我这的照胶仪有直接的biotin选项,所以你后面的问题我不太拿得准,看看别人的回答吧,呵呵
6楼2011-04-20 22:38:19
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yuxia82012

木虫 (著名写手)

呵呵,请问你是在哪里?我们这边照胶仪貌似还没这选项,我在上海有机所
在等待中涅槃重生
7楼2011-04-20 22:39:52
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s1523466

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by yuxia82012 at 2011-04-20 22:19:07
我还有几个问题,就是我能不能直接跑完胶不转膜检测,楼上说的干胶仪是什么东东,不转膜的话一定得用吗?
我的DNA链长只有20多个碱基,一般跑多大浓度的胶合适?
谢谢了

楼主做出来了么,可以请教一下吗
8楼2018-07-02 10:30:51
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yuxia82012

木虫 (著名写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by s1523466 at 2018-07-01 14:30:51
楼主做出来了么,可以请教一下吗...

做出来了,最后用agrose做出来的。时间太久了,细节记不清出了

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在等待中涅槃重生
9楼2018-07-02 10:33:20
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s1523466

新虫 (小有名气)

是用琼脂糖区分的蛋白和蛋白和核酸的复合物吗

发自小木虫IOS客户端
10楼2018-07-02 10:34:52
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