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yuxia82012

木虫 (著名写手)

[求助] 板上有做过Gel-shift的朋友没？

最近准备做这个，主要是检验蛋白和DNA的结合作用，我是把可能结合的DNA合成为5‘-Biotin的引物，表达蛋白反应后再跑聚丙烯酰胺的非变性胶，后面用照胶仪检测荧光，由于是第一次做，也没什么经验，不知道各位有什么建议以及注意事项没？
还有一点不确定的是这个蛋白结合DNA位点是结合双链的还是单链的，如果是双链的，我能不能合成一对互补引物通过退火是她们变成双链再反应？
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在等待中涅槃重生
1楼 2011-04-20 16:44:02
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elvias

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励热心朋友 2011-04-20 23:08:13
1.我用biotin的时候都是转膜去显影，以前试过直接显效果不太好，不过你可以试试，用同位素时我都是用干胶仪干胶后显影，因为同位素灵敏度较高。
2.4%-6%的都可以，推荐用6%，胶要结实点便于操作，你可以在空泳道加上一点有颜色的loading，一般跑到距下沿1/3处就差不多了
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4楼2011-04-20 22:28:34
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elvias

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
yuxia82012(金币+1): 非常好的建议 2011-04-20 22:14:55
西瓜(金币+2): 鼓励 2011-04-20 23:07:33
西瓜(金币+3, EPI+1): 热心，专业的高手 2011-04-20 23:08:49
1.标记的探针与结合蛋白需要在室温下结合一段时间，一般为10-20分钟。
2.如果是检验可能的结合还需要做探针的冷竞争反应。
3.注意下电泳时间和转膜的时间，如果你是用干胶仪的话就需要注意电泳的时间，一般为10v/cm.。
4.结合实验需要用双链的探针，可以使用退火的双链探针。
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2楼2011-04-20 21:45:25
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yuxia82012

木虫 (著名写手)
我还有几个问题，就是我能不能直接跑完胶不转膜检测，楼上说的干胶仪是什么东东，不转膜的话一定得用吗？
我的DNA链长只有20多个碱基，一般跑多大浓度的胶合适？
谢谢了
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在等待中涅槃重生
3楼2011-04-20 22:19:07
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yuxia82012

木虫 (著名写手)
显影的话就像杂交那样子吗？是不是还要定对应的抗体？还是直接紫外激发后检测？
另外这个灵敏度高不高？直接照时就用照胶仪就可以看见吗，还是得有具体的波长来照射？问题有点多，呵呵，麻烦了
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在等待中涅槃重生
5楼2011-04-20 22:33:23
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