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pamuk

铁虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】克隆Amp/Kan选择以及蓝白筛选 已有3人参与

关于克隆有几个问题盼高人解答:
1.正常来说AMP和卡那霉素做平板都可以,但是我使用的克隆试剂盒上特别提到,a.如果是最大化转导;b.克隆大片段PCR产物(>1000bp)c.使用卡那霉素筛选;满足这三个条件就用regular protocol

如果是快速转导就用rapid protocol

当然我希望的是最大化转导,因为是做的是环境基因组,而且PCR产物也大于1kb。之前都是觉得用AMP是没有任何问题的,但是这里这样特别提醒是不是意味着我只能用卡那霉素筛选啊?

2.蓝白斑筛选一般需要3个试剂:Amp、X-gal、IPTG,但是我的试剂盒上提到不要使用IPTG?这是什么道理。。。
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pamuk

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-07-31 22:53:35:
你用的什么细胞?什么载体?X-gal是不是也只是在做对照的时候才用得上啊?
我以前用的topo载体,top-10细胞做克隆,是不需要蓝白筛选的,所以IPTG、X-gal都用不上,利用的连接原理也和使用T4连接酶的那种不一样

用的是DH5a感受态,pCR2.1载体(Invitrogen)载体,连接原理是与T4不一样,哦,看来你使用的是跟我的很像啊,盼你详细解答啊。。。
10楼2010-07-31 22:59:20
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louli

铜虫 (小有名气)

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
看天(金币+1):鼓励回答 2010-07-31 22:23:23
IPTG不是诱导蛋白的吗,你是转化之后跑蛋白电泳吗,至于是用氨苄还是卡那霉素你做个对照就行了,它的选择得看载体图谱。
2楼2010-07-31 22:18:51
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pamuk

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by louli at 2010-07-31 22:18:51:
IPTG不是诱导蛋白的吗,你是转化之后跑蛋白电泳吗,至于是用氨苄还是卡那霉素你做个对照就行了,它的选择得看载体图谱。

是啊,就是利用诱导做蓝白斑筛选,以前看Takara的连接试剂盒就是这么做的,换了个克隆体系,说明书也是英文的,特别提到这点,很多地方与之前的做法都不一样,不理解。。。
3楼2010-07-31 22:21:20
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louli

铜虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
没有关系啊 我酶切之后连接就用宝生物的T4连接酶连接,就直接转化啦 也不用什么试剂盒啊
4楼2010-07-31 22:24:57
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