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TA克隆遇到的问题
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各位晚上好，最近做克隆，一直做不出来，很是郁闷。希望各位虫子能够解疑。问题如下： 我克隆程序是涂板、菌落PCR检测、扩大培养。以下图片是我PCR检测的结果，最亮的带为目的片段（带虽然不是很亮很纯），接着220rpm，37摄氏度扩大培养，两天后都没长起来，什么原因？（PS:扩大培养用培养液与平板成分除前者未加琼脂粉之外其余均一致)  |
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 科研 | 【分子生物】EPI帖 |
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【答案】应助回帖
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西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good!第一个MolEPI，恭喜！ 2011-08-26 11:27:17
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good!第一个MolEPI，恭喜！ 2011-08-26 11:27:17
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分析以下几点： 1 通过挑取单菌落PCR验证，有目的条带，切条带较亮，应该说明前面的连接没有问题，没有连接成功菌落验证是不会出现特异条带的，何况普通的TA克隆连接效率还是挺高的。 2 PCR 使用的是通用引物还是特异性引物？ 在排除杂菌污染情况下，通用引物一般不会扩增结果会有这么多非特异性扩增，如果楼主上图使用的是特异性引物，建议使用通用引物试试。如果是TA克隆，后面的测序也是使用M13进行测序的，如果M13通用引物扩增产生多条带，那测序也会有重叠锋出现，很难测序成功。 3 摇菌过程中，可以常观察，如果菌液先变浑浊，后逐渐变清，且有菌落碎片产生，应该是噬菌体污染了。 附个人TA克隆菌落PCR验证操作： 准备灭菌PCR管和无菌水，取10ul无菌水至PCR管中，枪头挑取菌落（DH5a,BL21）至PCR管中，吹打混匀。取3ul做PCR（25ul体系），剩余7ul菌落悬浮液，4度保存。PCR程序第一步预变性5min,PCR验证阳性克隆后，将剩余的7ul菌落悬浮液接种至相应抗性液体培养基中培养10-16h,用于菌液测序，提取质粒，菌种保存。 |
10楼2011-08-26 09:12:10
