| 查看: 2316 | 回复: 10 | ||||
| 本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看 | ||||
[求助]
TA克隆遇到的问题
|
||||
|
各位晚上好，最近做克隆，一直做不出来，很是郁闷。希望各位虫子能够解疑。问题如下： 我克隆程序是涂板、菌落PCR检测、扩大培养。以下图片是我PCR检测的结果，最亮的带为目的片段（带虽然不是很亮很纯），接着220rpm，37摄氏度扩大培养，两天后都没长起来，什么原因？（PS:扩大培养用培养液与平板成分除前者未加琼脂粉之外其余均一致)  |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 科研 | 【分子生物】EPI帖 |
» 猜你喜欢
推荐一些20种氨基酸检测的实际应用案例
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有204人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 请教一个基因的扩增，TA克隆问题
已经有6人回复
- 在克隆的时候你遇见过这样的问题吗？
已经有11人回复
- 从 单克隆杂交瘤细胞 到 抗体序列（抗体测序）
已经有24人回复
- 虫子们有谁做过TA克隆呀？额想知道TA克隆的具体的实验步骤
已经有25人回复
- SDS-PAGE电泳遇到的问题
已经有26人回复
- 线粒体DNA纯化前亮带单一，纯化后出现亮暗各一条带
已经有10人回复
- 【求助/交流】单克隆摇菌16小时后LB液体培养基还没有变混浊求原因
已经有23人回复
- 【求助/交流】DGGE遇到了难题，向大家求助！
已经有10人回复
- 【求助/交流】求助TA克隆问题
已经有10人回复
wyzl2007
金虫 (小有名气)
- 应助: 10 (幼儿园)
- 金币: 1135.2
- 红花: 2
- 帖子: 250
- 在线: 58.8小时
- 虫号: 167324
- 注册: 2006-01-15
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
2楼2011-08-23 08:58:17
longage.gene
银虫 (小有名气)
- MolEPI: 2
- 应助: 4 (幼儿园)
- 金币: 743.7
- 散金: 4
- 红花: 2
- 帖子: 121
- 在线: 296.9小时
- 虫号: 1359202
- 注册: 2011-08-02
- 专业: 微生物生理与生物化学
3楼2011-08-23 10:34:51
4楼2011-08-23 14:35:42
zgb1982
木虫 (正式写手)
- 应助: 46 (小学生)
- 金币: 2895.3
- 红花: 3
- 帖子: 536
- 在线: 227.2小时
- 虫号: 664342
- 注册: 2008-11-29
- 专业: 植物病理学
5楼2011-08-23 15:51:08
6楼2011-08-23 20:10:29
空谷幽风
金虫 (正式写手)
- MolEPI: 32
- 应助: 13 (小学生)
- 贵宾: 0.05
- 金币: 1106.1
- 散金: 500
- 红花: 13
- 帖子: 615
- 在线: 116.5小时
- 虫号: 714271
- 注册: 2009-03-04
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
7楼2011-08-23 21:16:46
8楼2011-08-24 09:09:18
9楼2011-08-26 08:41:38
cexoihtydx
金虫 (正式写手)
- MolEPI: 5
- 应助: 4 (幼儿园)
- 金币: 581.3
- 散金: 906
- 红花: 5
- 帖子: 766
- 在线: 263.3小时
- 虫号: 722752
- 注册: 2009-03-14
- 性别: GG
- 专业: 人类遗传学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good!第一个MolEPI，恭喜！ 2011-08-26 11:27:17
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good!第一个MolEPI，恭喜！ 2011-08-26 11:27:17
|
分析以下几点： 1 通过挑取单菌落PCR验证，有目的条带，切条带较亮，应该说明前面的连接没有问题，没有连接成功菌落验证是不会出现特异条带的，何况普通的TA克隆连接效率还是挺高的。 2 PCR 使用的是通用引物还是特异性引物？ 在排除杂菌污染情况下，通用引物一般不会扩增结果会有这么多非特异性扩增，如果楼主上图使用的是特异性引物，建议使用通用引物试试。如果是TA克隆，后面的测序也是使用M13进行测序的，如果M13通用引物扩增产生多条带，那测序也会有重叠锋出现，很难测序成功。 3 摇菌过程中，可以常观察，如果菌液先变浑浊，后逐渐变清，且有菌落碎片产生，应该是噬菌体污染了。 附个人TA克隆菌落PCR验证操作： 准备灭菌PCR管和无菌水，取10ul无菌水至PCR管中，枪头挑取菌落（DH5a,BL21）至PCR管中，吹打混匀。取3ul做PCR（25ul体系），剩余7ul菌落悬浮液，4度保存。PCR程序第一步预变性5min,PCR验证阳性克隆后，将剩余的7ul菌落悬浮液接种至相应抗性液体培养基中培养10-16h,用于菌液测序，提取质粒，菌种保存。 |
10楼2011-08-26 09:12:10
30