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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请教一个基因的扩增，TA克隆问题
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zw198626

铁杆木虫 (小有名气)

[求助] 请教一个基因的扩增，TA克隆问题

各位大侠，
小弟最近在用mRNA扩增一个基因，跑胶后电泳带子特异。直接用PCR产物未经纯化或切胶纯化直接做TA克隆。抽提转化子的质粒，跑胶将变大的质粒送测序。但是得到的连接产物，经测序发现大小正确，但是序列为一段没有任何意义的DNA序列。在NCBI做blast也找不到任何匹配的序列。不知各位有没有这样的经历？或有大侠给指点下迷津的？

再次拜谢！
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1楼 2012-02-03 10:16:40
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ivxy

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+2): 有道理 2012-02-03 13:39:44
zw198626: 金币+10, ★有帮助 2012-04-28 09:33:07
1、非编码区
2、扩到内含子序列
3、基因在该段的变异大，不同物种的该基因差异也比较大
4、PCR扩增中的错配
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2楼2012-02-03 11:08:02
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
小丹木木(金币+2, 专家考核): 运气还不错了。仰慕ing 2012-02-03 13:41:09
昨天拿到的测序结果也是这样，克隆的是植物的基因，连到载体上后，用M13f测得结果，blast得到的是大肠杆菌的细胞分裂基因序列！！还好有一个正确的！！
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jiayoubashaonian
3楼2012-02-03 11:14:05
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cgspider

木虫 (正式写手)
碰到过，提交后说是genbank里 没有相似序列。。。
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你的能力撑不起你的野心
4楼2012-02-06 16:15:32
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zw198626

铁杆木虫 (小有名气)
各位，除了多挑克隆测序外还有什么好的解决办法么？
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5楼2012-02-08 10:27:39
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笑看人生417

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+2): 鼓励新虫回帖应助 2012-02-20 16:40:31
这是假阳性，很正常。克服假阳性的方法，连接产物的浓度和比例把握好，再者可以进行蓝白斑筛选，跑胶时多挑些菌，只挑最亮的测序，希望能帮到你呵呵
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6楼2012-02-20 15:32:42
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137167741

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+1): 有道理啊 2012-02-22 18:44:21
所以每次测序一定要2~3个平行样，这样才不至于是不知道是因为测序问题，还是因为自己的PCR的问题。
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总有一天我要修改用户名。
7楼2012-02-22 16:10:20
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