应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】请教关于大肠杆菌lamda RED重组问题
241/3返回列表123下一页
查看: 5103  |  回复: 23
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

hanjun80

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】请教关于大肠杆菌lamda RED重组问题 已有17人参与

最近用lamda RED重组敲除大肠杆菌乳酸脱氢酶基因。可是一直出问题，分析不出来问题出在哪里，所以向各位大侠请教。以下是我的实验方法：

1、用带有45bp同源臂的引物，PCR扩增卡那霉素或氯霉素基因；
2、用切胶回收的方法纯化PCR产物，100微升PCR产物最终浓缩为50微升；
3、含有PKD46质粒的E. coli W1485菌株（K-12菌株变种）在LB中培养，OD＝0.2时加入L－Ara诱导酶们表达，OD在0.5左右用CaCl2制作感受态；
4、化学转化，而后涂卡那霉素（40ppm）平板；
5、一天后长出几十个菌落（据说RED重组效率很低，只能长出几个菌落来，偶为什么会长这么多？），每个菌落，接到两个平板上，其中一个带氨苄青霉素和卡那霉素抗性，另外一个只有卡那霉素抗性；挑出只在卡那霉素平板上生长的菌株，扩大培养（加了卡那霉素的液体LB培养基）；
6、扩大培养的菌提取基因组DNA（电泳的时候没有发现质粒的条带），用PCR扩增卡那霉素抗性基因，扩增不出来……

为什么出现6这个现象？做了好几组，总是不成功，菌种从W1485换成BL21也不行……
为什么会有这些假阳性？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
我笃信:人定胜天！
1楼 2010-04-11 13:44:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

gandalf886

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
1949stone(金币+4): 2010-04-11 18:49
hanjun80(金币+3):多谢热心回复！ 2010-04-11 20:10
1、用带有45bp同源臂的引物，PCR扩增卡那霉素或氯霉素基因；
同源臂可以延长。
2、用切胶回收的方法纯化PCR产物，100微升PCR产物最终浓缩为50微升；
你用什么酶P的，文献上说是taq加pfu，DpnI消化降解pKD3/4模板。
3、含有PKD46质粒的E. coli W1485菌株（K-12菌株变种）在LB中培养，OD＝0.2时加入L－Ara诱导酶们表达，OD在0.5左右用CaCl2制作感受态；
ara浓度是多少，文献说在初始期即加入，1mM或10mM，这要看菌里有没有araBAD这几个基因，另外，一定是30度做感受态，一定是电转。
4、化学转化，而后涂卡那霉素（40ppm）平板；
40ppm是多少，文献是25ug/mL。
5、一天后长出几十个菌落（据说RED重组效率很低，只能长出几个菌落来，偶为什么会长这么多？），每个菌落，接到两个平板上，其中一个带氨苄青霉素和卡那霉素抗性，另外一个只有卡那霉素抗性；挑出只在卡那霉素平板上生长的菌株，扩大培养（加了卡那霉素的液体LB培养基）；
这一步没必要，可以先筛到重组子，再去消除pKD46
6、扩大培养的菌提取基因组DNA（电泳的时候没有发现质粒的条带），用PCR扩增卡那霉素抗性基因，扩增不出来……
不用提DNA，菌落PCR就够了，引物要设在同源臂两侧，而不是用抗性基因引物去P。
赞一下(2人) 回复此楼
3楼2010-04-11 18:35:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhangjingfei01

木虫 (正式写手)
★
hanjun80(金币+1):谢谢参与
hanjun80(金币+2):多谢仁兄!PKD46辅助质粒的大肠杆菌(2000年的PNAS上面发表)同源片段不用那么长,35~60bp即可 2010-04-12 13:12
1、首先，增加同源臂的长度，我做时上下游同源臂一般为300-500bp；
2、用电转的方式进行，可以适当提高打靶片段的浓度；
赞一下(2人) 回复此楼
7楼2010-04-12 11:17:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yangbin1

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
这个问题我也遇到了主要解决方案：
1.缩短阿拉伯糖有到时间（1h足够，文献中给出的最小20min），诱导时间延长会使得自发突变的频率加大。
2.想办法用电转化，文献中一般都是用的电转化。
3.如果你缺失的这个基因对你这个菌本身很重要，缺失以后会致死，你也不能得到正确结果。
我现在在宿舍，关于相关文献你若需要明天可以到实验室后发给你，希望对你有帮助。
赞一下(3人) 回复此楼
18楼2011-05-29 23:28:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
★ ★ ★
1949stone(金币+3): 2010-04-11 18:49
hanjun80(金币+2):多谢热心回复！ 2010-04-11 20:09
hanjun80(金币+1): 2010-04-11 20:45
1.PCR扩增同源臂后未降解模板，这可能是后来出现假阳性的主要原因；
2.是否考虑电转化提高转化效率？
3.转化后用双抗板筛选阳性克隆；
4.转化前培养菌体用的温度是多少？
5.你的第6步进行PCR时是否有阳性和阴性对照？可能是你PCR有问题而非菌的问题。
赞一下(2人) 回复此楼
2楼2010-04-11 16:38:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hanjun80

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by zhuifeng7000 at 2010-04-11 16:38:49:
1.PCR扩增同源臂后未降解模板，这可能是后来出现假阳性的主要原因；
2.是否考虑电转化提高转化效率？
3.转化后用双抗板筛选阳性克隆；
4.转化前培养菌体用的温度是多少？
5.你的第6步进行PCR时是否有阳性和阴 ...

多谢兄台建议；还有以下问题需要请教：
1、PCR切胶回收的，回收1.5/1.0左右片段；而且事后为了检查是否有假阳性，我还专门从阳性克隆提纯质粒检测——检测结果没有质粒；

2、我也一直在考虑是不是化学转化的问题，但是无奈实验室不具备电转条件；

3、没问题，不过又得多一步删除PKD46步骤；

4、制作感受态培养温度为30度；

5、做PCR时候，1）设没有转化的菌株的基因组DNA为阴性对照，这个扩增不出目的片段；2）设PKD3/PKD4质粒为阳性对照阴性对照，这个可以扩增出目的片段;3）设扩增大肠杆菌基因组上异柠檬酸裂解酶（因为这个基因大小与卡那霉素抗性基因相似）作为PCR体系判断实验，这个可以扩增出目的片段；

综上，实验仍然没有成功，还请仁兄根据以上条件，提出进一步建议。
先行谢过！

[ Last edited by hanjun80 on 2010-4-11 at 20:44 ]
赞一下 回复此楼
我笃信:人定胜天！
4楼2010-04-11 20:33:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hanjun80

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by gandalf886 at 2010-04-11 18:35:35:
1、用带有45bp同源臂的引物，PCR扩增卡那霉素或氯霉素基因；
同源臂可以延长。
2、用切胶回收的方法纯化PCR产物，100微升PCR产物最终浓缩为50微升；
你用什么酶P的，文献上说是taq加pfu，DpnI消化降解pKD3/4模 ...

多谢兄台建议！

我做过进一步的改进实验，如下，请您根据这些，帮忙分析一下原因：
1、我用的酶是fermentas的pfu酶；我没有用DpnI降解模版质粒；但事后我用碱裂法提取阳性克隆的质粒，并没有提出来；
2、W1485的araBAD基因没有失活，所以我用的L－ara浓度是10mM；
3、因为实验室不具备电转条件，所以只能用化学转化；
4、40ppm的卡纳霉素就是40ug/mL；但是我用的氯霉素是8ug/mL；
5、因为菌落PCR扩增不出来，所以才用基因组DNA扩增，但是我像上位仁兄的建议那样，我做了阴性和阳性对照实验了……

请您帮助根据以上的这些信息进一步分析下原因，先行谢过
赞一下 回复此楼
我笃信:人定胜天！
5楼2010-04-11 20:42:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yuanfeng

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
hanjun80(金币+1):谢谢参与
hanjun80(金币+3):多谢仁兄建议 2010-04-12 13:11
lstt09nk(金币+3):感谢交流~~很热心~~ 2010-08-08 21:35:56
氯化钙转化恐怕是最大的问题吧。我没有看到文献上说用氯化钙方法转化DNA片段的，尽量联系下用电转吧。还有就是DNA片段的浓度和感受态细胞的浓度在做高些吧。DNA我们最后都是浓缩到500~1000ng/ul,电转时100ul的细胞加1ul片段。
1、我用的酶是fermentas的pfu酶；我没有用DpnI降解模版质粒；但事后我用碱裂法提取阳性克隆的质粒，并没有提出来；
这一步我们也不降解，pcr结束后切胶回收，纯化浓缩。
2、W1485的araBAD基因没有失活，所以我用的L－ara浓度是10mM；
这一步没什么为问题，可以一开始就加，也可以OD在0.1~0.2之间加，最后可以多养会，我们一般养到OD0.7左右。
3、因为实验室不具备电转条件，所以只能用化学转化；
这个化学转化恐怕不行吧
4、40ppm的卡纳霉素就是40ug/mL；但是我用的氯霉素是8ug/mL；
氯霉素太低了些
5、因为菌落PCR扩增不出来，所以才用基因组DNA扩增，但是我像上位仁兄的建议那样，我做了阴性和阳性对照实验了……
赞一下(2人) 回复此楼
6楼2010-04-12 08:38:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

berg

银虫 (正式写手)
★
hanjun80(金币+1):谢谢参与
hanjun80(金币+2):嗯,转化效率的确是个问题呀...... 2010-04-12 13:13
引用回帖:
Originally posted by hanjun80 at 2010-04-11 13:44:29:
最近用lamda RED重组敲除大肠杆菌乳酸脱氢酶基因。可是一直出问题，分析不出来问题出在哪里，所以向各位大侠请教。以下是我的实验方法：

1、用带有45bp同源臂的引物，PCR扩增卡那霉素或氯霉素基因；
2、用切胶 ...

red重组的两个关键条件是重组片段的浓度和转化效率，胶回收的后片段用乙醇沉淀进一步提高浓度，电转化是必须的，化转不能满足基因敲除的需要！
赞一下(1人) 回复此楼
8楼2010-04-12 12:59:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhangjingfei01

木虫 (正式写手)
hanjun80(金币+2):可惜的是,偶没有这个质粒呀,能交换么? 2010-04-12 16:12
pkobeg质粒，比那个pKD46好一些。
赞一下 回复此楼
9楼2010-04-12 14:04:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xmuwangym

新虫 (初入文坛)
★
hanjun80(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
Originally posted by berg at 2010-04-12 12:59:46:


red重组的两个关键条件是重组片段的浓度和转化效率，胶回收的后片段用乙醇沉淀进一步提高浓度，电转化是必须的，化转不能满足基因敲除的需要！

您好！能麻烦您介绍一下这个质粒吗？？谢谢！
赞一下(1人) 回复此楼
厚德载物
10楼2010-07-09 21:46:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 hanjun80 的主题更新
241/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿985，本科211，0817化学工程与技术319求调剂 +4 Liwangman 2026-03-15 4/200 2026-03-16 08:01 by wang_dand
[基金申请] NSFC申报书里申请人简历中代表性论著还需要在申报书最后的附件里面再上传一遍吗 20+5 NSFC2026我来了 2026-03-10 14/700 2026-03-15 23:53 by 不负韶华的虎
[考研] 化学调剂0703 +7 啊我我的 2026-03-11 7/350 2026-03-15 23:03 by 凌千颂111
[考研] 中科大材料专硕319求调剂 +3 孟鑫材料 2026-03-13 3/150 2026-03-14 18:10 by houyaoxu
[考研] 328求调剂 +3 5201314Lsy！ 2026-03-13 6/300 2026-03-14 15:31 by hyswxzs
[考研] 一志愿天津大学，英一数二305分求调剂，四六级已过 +8 小小番的茄 2026-03-09 8/400 2026-03-14 01:53 by JourneyLucky
[考研] 一志愿安徽大学材料工程专硕313分，求调剂的学校 +8 Yu先生 2026-03-10 10/500 2026-03-14 01:04 by JourneyLucky
[基金申请] 有必要更换申报口吗 20+3 fannyamoy 2026-03-11 3/150 2026-03-14 00:52 by zhanghaozhu
[考研] b区环境工程求调剂 +4 Maps1 2026-03-10 6/300 2026-03-14 00:23 by JourneyLucky
[考研] 0805，333求调剂 +3 112253525 2026-03-10 3/150 2026-03-13 23:42 by JourneyLucky
[考研] 0703化学一志愿211 总分320求调剂 +5 玛卡巴卡啊哈 2026-03-11 5/250 2026-03-13 21:40 by JourneyLucky
[考研] 26调剂/材料科学与工程/总分295/求收留 +9 2026调剂侠 2026-03-12 9/450 2026-03-13 20:46 by 18595523086
[考研] 求调剂 +7 18880831720 2026-03-11 7/350 2026-03-13 16:10 by JourneyLucky
[考研] 工科278分求调剂 +5 周慢热啊 2026-03-12 7/350 2026-03-13 15:49 by JourneyLucky
[考研] 295求调剂 +3 小匕仔汁 2026-03-12 3/150 2026-03-13 15:17 by vgtyfty
[考研] 274求调剂 +3 S.H1 2026-03-12 3/150 2026-03-13 15:15 by JourneyLucky
[考研] 304求调剂（085602一志愿985） +12 化工人999 2026-03-09 12/600 2026-03-13 12:02 by JourneyLucky
[考研] 289求调剂 +3 李政莹 2026-03-12 3/150 2026-03-13 11:02 by 求调剂zz
[考研] 333求调剂 +3 152697 2026-03-12 4/200 2026-03-13 07:08 by Iveryant
[硕博家园] 木虫好像不热闹了，是不是？ +4 偏振片 2026-03-10 4/200 2026-03-10 09:51 by longwave
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭