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hanjun80超级版主
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[交流]
【求助/交流】请教关于大肠杆菌lamda RED重组问题 已有17人参与
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最近用lamda RED重组敲除大肠杆菌乳酸脱氢酶基因。可是一直出问题，分析不出来问题出在哪里，所以向各位大侠请教。以下是我的实验方法： 1、用带有45bp同源臂的引物，PCR扩增卡那霉素或氯霉素基因； 2、用切胶回收的方法纯化PCR产物，100微升PCR产物最终浓缩为50微升； 3、含有PKD46质粒的E. coli W1485菌株（K-12菌株变种）在LB中培养，OD＝0.2时加入L－Ara诱导酶们表达，OD在0.5左右用CaCl2制作感受态； 4、化学转化，而后涂卡那霉素（40ppm）平板； 5、一天后长出几十个菌落（据说RED重组效率很低，只能长出几个菌落来，偶为什么会长这么多？），每个菌落，接到两个平板上，其中一个带氨苄青霉素和卡那霉素抗性，另外一个只有卡那霉素抗性；挑出只在卡那霉素平板上生长的菌株，扩大培养（加了卡那霉素的液体LB培养基）； 6、扩大培养的菌提取基因组DNA（电泳的时候没有发现质粒的条带），用PCR扩增卡那霉素抗性基因，扩增不出来…… 为什么出现6这个现象？做了好几组，总是不成功，菌种从W1485换成BL21也不行…… 为什么会有这些假阳性？ |
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1949stone(金币+4): 2010-04-11 18:49
hanjun80(金币+3):多谢热心回复！ 2010-04-11 20:10
1949stone(金币+4): 2010-04-11 18:49
hanjun80(金币+3):多谢热心回复！ 2010-04-11 20:10
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1、用带有45bp同源臂的引物，PCR扩增卡那霉素或氯霉素基因； 同源臂可以延长。 2、用切胶回收的方法纯化PCR产物，100微升PCR产物最终浓缩为50微升； 你用什么酶P的，文献上说是taq加pfu，DpnI消化降解pKD3/4模板。 3、含有PKD46质粒的E. coli W1485菌株（K-12菌株变种）在LB中培养，OD＝0.2时加入L－Ara诱导酶们表达，OD在0.5左右用CaCl2制作感受态； ara浓度是多少，文献说在初始期即加入，1mM或10mM，这要看菌里有没有araBAD这几个基因，另外，一定是30度做感受态，一定是电转。 4、化学转化，而后涂卡那霉素（40ppm）平板； 40ppm是多少，文献是25ug/mL。 5、一天后长出几十个菌落（据说RED重组效率很低，只能长出几个菌落来，偶为什么会长这么多？），每个菌落，接到两个平板上，其中一个带氨苄青霉素和卡那霉素抗性，另外一个只有卡那霉素抗性；挑出只在卡那霉素平板上生长的菌株，扩大培养（加了卡那霉素的液体LB培养基）； 这一步没必要，可以先筛到重组子，再去消除pKD46 6、扩大培养的菌提取基因组DNA（电泳的时候没有发现质粒的条带），用PCR扩增卡那霉素抗性基因，扩增不出来…… 不用提DNA，菌落PCR就够了，引物要设在同源臂两侧，而不是用抗性基因引物去P。 |
3楼2010-04-11 18:35:35
zhangjingfei01
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7楼2010-04-12 11:17:47
yangbin1
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18楼2011-05-29 23:28:56
zhuifeng7000
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2楼2010-04-11 16:38:49
hanjun80
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多谢兄台建议；还有以下问题需要请教： 1、PCR切胶回收的，回收1.5/1.0左右片段；而且事后为了检查是否有假阳性，我还专门从阳性克隆提纯质粒检测——检测结果没有质粒； 2、我也一直在考虑是不是化学转化的问题，但是无奈实验室不具备电转条件； 3、没问题，不过又得多一步删除PKD46步骤； 4、制作感受态培养温度为30度； 5、做PCR时候，1）设没有转化的菌株的基因组DNA为阴性对照，这个扩增不出目的片段；2）设PKD3/PKD4质粒为阳性对照阴性对照，这个可以扩增出目的片段;3）设扩增大肠杆菌基因组上异柠檬酸裂解酶（因为这个基因大小与卡那霉素抗性基因相似）作为PCR体系判断实验，这个可以扩增出目的片段； 综上，实验仍然没有成功，还请仁兄根据以上条件，提出进一步建议。 先行谢过！ [ Last edited by hanjun80 on 2010-4-11 at 20:44 ] |
4楼2010-04-11 20:33:50
hanjun80
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多谢兄台建议！ 我做过进一步的改进实验，如下，请您根据这些，帮忙分析一下原因： 1、我用的酶是fermentas的pfu酶；我没有用DpnI降解模版质粒；但事后我用碱裂法提取阳性克隆的质粒，并没有提出来； 2、W1485的araBAD基因没有失活，所以我用的L－ara浓度是10mM； 3、因为实验室不具备电转条件，所以只能用化学转化； 4、40ppm的卡纳霉素就是40ug/mL；但是我用的氯霉素是8ug/mL； 5、因为菌落PCR扩增不出来，所以才用基因组DNA扩增，但是我像上位仁兄的建议那样，我做了阴性和阳性对照实验了…… 请您帮助根据以上的这些信息进一步分析下原因，先行谢过 |
5楼2010-04-11 20:42:54
★ ★ ★ ★
hanjun80(金币+1):谢谢参与
hanjun80(金币+3):多谢仁兄建议 2010-04-12 13:11
lstt09nk(金币+3):感谢交流~~很热心~~ 2010-08-08 21:35:56
hanjun80(金币+1):谢谢参与
hanjun80(金币+3):多谢仁兄建议 2010-04-12 13:11
lstt09nk(金币+3):感谢交流~~很热心~~ 2010-08-08 21:35:56
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氯化钙转化恐怕是最大的问题吧。我没有看到文献上说用氯化钙方法转化DNA片段的，尽量联系下用电转吧。还有就是DNA片段的浓度和感受态细胞的浓度在做高些吧。DNA我们最后都是浓缩到500~1000ng/ul,电转时100ul的细胞加1ul片段。 1、我用的酶是fermentas的pfu酶；我没有用DpnI降解模版质粒；但事后我用碱裂法提取阳性克隆的质粒，并没有提出来； 这一步我们也不降解，pcr结束后切胶回收，纯化浓缩。 2、W1485的araBAD基因没有失活，所以我用的L－ara浓度是10mM； 这一步没什么为问题，可以一开始就加，也可以OD在0.1~0.2之间加，最后可以多养会，我们一般养到OD0.7左右。 3、因为实验室不具备电转条件，所以只能用化学转化； 这个化学转化恐怕不行吧 4、40ppm的卡纳霉素就是40ug/mL；但是我用的氯霉素是8ug/mL； 氯霉素太低了些 5、因为菌落PCR扩增不出来，所以才用基因组DNA扩增，但是我像上位仁兄的建议那样，我做了阴性和阳性对照实验了…… |
6楼2010-04-12 08:38:55
8楼2010-04-12 12:59:46
zhangjingfei01
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