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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】请教关于大肠杆菌lamda RED重组问题
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hanjun80

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】请教关于大肠杆菌lamda RED重组问题 已有17人参与

最近用lamda RED重组敲除大肠杆菌乳酸脱氢酶基因。可是一直出问题，分析不出来问题出在哪里，所以向各位大侠请教。以下是我的实验方法：

1、用带有45bp同源臂的引物，PCR扩增卡那霉素或氯霉素基因；
2、用切胶回收的方法纯化PCR产物，100微升PCR产物最终浓缩为50微升；
3、含有PKD46质粒的E. coli W1485菌株（K-12菌株变种）在LB中培养，OD＝0.2时加入L－Ara诱导酶们表达，OD在0.5左右用CaCl2制作感受态；
4、化学转化，而后涂卡那霉素（40ppm）平板；
5、一天后长出几十个菌落（据说RED重组效率很低，只能长出几个菌落来，偶为什么会长这么多？），每个菌落，接到两个平板上，其中一个带氨苄青霉素和卡那霉素抗性，另外一个只有卡那霉素抗性；挑出只在卡那霉素平板上生长的菌株，扩大培养（加了卡那霉素的液体LB培养基）；
6、扩大培养的菌提取基因组DNA（电泳的时候没有发现质粒的条带），用PCR扩增卡那霉素抗性基因，扩增不出来……

为什么出现6这个现象？做了好几组，总是不成功，菌种从W1485换成BL21也不行……
为什么会有这些假阳性？
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我笃信:人定胜天！
1楼 2010-04-11 13:44:29
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gandalf886

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
1949stone(金币+4): 2010-04-11 18:49
hanjun80(金币+3):多谢热心回复！ 2010-04-11 20:10
1、用带有45bp同源臂的引物，PCR扩增卡那霉素或氯霉素基因；
同源臂可以延长。
2、用切胶回收的方法纯化PCR产物，100微升PCR产物最终浓缩为50微升；
你用什么酶P的，文献上说是taq加pfu，DpnI消化降解pKD3/4模板。
3、含有PKD46质粒的E. coli W1485菌株（K-12菌株变种）在LB中培养，OD＝0.2时加入L－Ara诱导酶们表达，OD在0.5左右用CaCl2制作感受态；
ara浓度是多少，文献说在初始期即加入，1mM或10mM，这要看菌里有没有araBAD这几个基因，另外，一定是30度做感受态，一定是电转。
4、化学转化，而后涂卡那霉素（40ppm）平板；
40ppm是多少，文献是25ug/mL。
5、一天后长出几十个菌落（据说RED重组效率很低，只能长出几个菌落来，偶为什么会长这么多？），每个菌落，接到两个平板上，其中一个带氨苄青霉素和卡那霉素抗性，另外一个只有卡那霉素抗性；挑出只在卡那霉素平板上生长的菌株，扩大培养（加了卡那霉素的液体LB培养基）；
这一步没必要，可以先筛到重组子，再去消除pKD46
6、扩大培养的菌提取基因组DNA（电泳的时候没有发现质粒的条带），用PCR扩增卡那霉素抗性基因，扩增不出来……
不用提DNA，菌落PCR就够了，引物要设在同源臂两侧，而不是用抗性基因引物去P。
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3楼2010-04-11 18:35:35
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zhangjingfei01

木虫 (正式写手)
★
hanjun80(金币+1):谢谢参与
hanjun80(金币+2):多谢仁兄!PKD46辅助质粒的大肠杆菌(2000年的PNAS上面发表)同源片段不用那么长,35~60bp即可 2010-04-12 13:12
1、首先，增加同源臂的长度，我做时上下游同源臂一般为300-500bp；
2、用电转的方式进行，可以适当提高打靶片段的浓度；
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7楼2010-04-12 11:17:47
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yangbin1

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
这个问题我也遇到了主要解决方案：
1.缩短阿拉伯糖有到时间（1h足够，文献中给出的最小20min），诱导时间延长会使得自发突变的频率加大。
2.想办法用电转化，文献中一般都是用的电转化。
3.如果你缺失的这个基因对你这个菌本身很重要，缺失以后会致死，你也不能得到正确结果。
我现在在宿舍，关于相关文献你若需要明天可以到实验室后发给你，希望对你有帮助。
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18楼2011-05-29 23:28:56
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普通回帖

zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
★ ★ ★
1949stone(金币+3): 2010-04-11 18:49
hanjun80(金币+2):多谢热心回复！ 2010-04-11 20:09
hanjun80(金币+1): 2010-04-11 20:45
1.PCR扩增同源臂后未降解模板，这可能是后来出现假阳性的主要原因；
2.是否考虑电转化提高转化效率？
3.转化后用双抗板筛选阳性克隆；
4.转化前培养菌体用的温度是多少？
5.你的第6步进行PCR时是否有阳性和阴性对照？可能是你PCR有问题而非菌的问题。
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2楼2010-04-11 16:38:49
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hanjun80

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by zhuifeng7000 at 2010-04-11 16:38:49:
1.PCR扩增同源臂后未降解模板，这可能是后来出现假阳性的主要原因；
2.是否考虑电转化提高转化效率？
3.转化后用双抗板筛选阳性克隆；
4.转化前培养菌体用的温度是多少？
5.你的第6步进行PCR时是否有阳性和阴 ...

多谢兄台建议；还有以下问题需要请教：
1、PCR切胶回收的，回收1.5/1.0左右片段；而且事后为了检查是否有假阳性，我还专门从阳性克隆提纯质粒检测——检测结果没有质粒；

2、我也一直在考虑是不是化学转化的问题，但是无奈实验室不具备电转条件；

3、没问题，不过又得多一步删除PKD46步骤；

4、制作感受态培养温度为30度；

5、做PCR时候，1）设没有转化的菌株的基因组DNA为阴性对照，这个扩增不出目的片段；2）设PKD3/PKD4质粒为阳性对照阴性对照，这个可以扩增出目的片段;3）设扩增大肠杆菌基因组上异柠檬酸裂解酶（因为这个基因大小与卡那霉素抗性基因相似）作为PCR体系判断实验，这个可以扩增出目的片段；

综上，实验仍然没有成功，还请仁兄根据以上条件，提出进一步建议。
先行谢过！

[ Last edited by hanjun80 on 2010-4-11 at 20:44 ]
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我笃信:人定胜天！
4楼2010-04-11 20:33:50
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hanjun80

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by gandalf886 at 2010-04-11 18:35:35:
1、用带有45bp同源臂的引物，PCR扩增卡那霉素或氯霉素基因；
同源臂可以延长。
2、用切胶回收的方法纯化PCR产物，100微升PCR产物最终浓缩为50微升；
你用什么酶P的，文献上说是taq加pfu，DpnI消化降解pKD3/4模 ...

多谢兄台建议！

我做过进一步的改进实验，如下，请您根据这些，帮忙分析一下原因：
1、我用的酶是fermentas的pfu酶；我没有用DpnI降解模版质粒；但事后我用碱裂法提取阳性克隆的质粒，并没有提出来；
2、W1485的araBAD基因没有失活，所以我用的L－ara浓度是10mM；
3、因为实验室不具备电转条件，所以只能用化学转化；
4、40ppm的卡纳霉素就是40ug/mL；但是我用的氯霉素是8ug/mL；
5、因为菌落PCR扩增不出来，所以才用基因组DNA扩增，但是我像上位仁兄的建议那样，我做了阴性和阳性对照实验了……

请您帮助根据以上的这些信息进一步分析下原因，先行谢过
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5楼2010-04-11 20:42:54
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yuanfeng

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
hanjun80(金币+1):谢谢参与
hanjun80(金币+3):多谢仁兄建议 2010-04-12 13:11
lstt09nk(金币+3):感谢交流~~很热心~~ 2010-08-08 21:35:56
氯化钙转化恐怕是最大的问题吧。我没有看到文献上说用氯化钙方法转化DNA片段的，尽量联系下用电转吧。还有就是DNA片段的浓度和感受态细胞的浓度在做高些吧。DNA我们最后都是浓缩到500~1000ng/ul,电转时100ul的细胞加1ul片段。
1、我用的酶是fermentas的pfu酶；我没有用DpnI降解模版质粒；但事后我用碱裂法提取阳性克隆的质粒，并没有提出来；
这一步我们也不降解，pcr结束后切胶回收，纯化浓缩。
2、W1485的araBAD基因没有失活，所以我用的L－ara浓度是10mM；
这一步没什么为问题，可以一开始就加，也可以OD在0.1~0.2之间加，最后可以多养会，我们一般养到OD0.7左右。
3、因为实验室不具备电转条件，所以只能用化学转化；
这个化学转化恐怕不行吧
4、40ppm的卡纳霉素就是40ug/mL；但是我用的氯霉素是8ug/mL；
氯霉素太低了些
5、因为菌落PCR扩增不出来，所以才用基因组DNA扩增，但是我像上位仁兄的建议那样，我做了阴性和阳性对照实验了……
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6楼2010-04-12 08:38:55
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berg

银虫 (正式写手)
★
hanjun80(金币+1):谢谢参与
hanjun80(金币+2):嗯,转化效率的确是个问题呀...... 2010-04-12 13:13
引用回帖:
Originally posted by hanjun80 at 2010-04-11 13:44:29:
最近用lamda RED重组敲除大肠杆菌乳酸脱氢酶基因。可是一直出问题，分析不出来问题出在哪里，所以向各位大侠请教。以下是我的实验方法：

1、用带有45bp同源臂的引物，PCR扩增卡那霉素或氯霉素基因；
2、用切胶 ...

red重组的两个关键条件是重组片段的浓度和转化效率，胶回收的后片段用乙醇沉淀进一步提高浓度，电转化是必须的，化转不能满足基因敲除的需要！
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8楼2010-04-12 12:59:46
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zhangjingfei01

木虫 (正式写手)
hanjun80(金币+2):可惜的是,偶没有这个质粒呀,能交换么? 2010-04-12 16:12
pkobeg质粒，比那个pKD46好一些。
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9楼2010-04-12 14:04:47
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xmuwangym

新虫 (初入文坛)
★
hanjun80(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
Originally posted by berg at 2010-04-12 12:59:46:


red重组的两个关键条件是重组片段的浓度和转化效率，胶回收的后片段用乙醇沉淀进一步提高浓度，电转化是必须的，化转不能满足基因敲除的需要！

您好！能麻烦您介绍一下这个质粒吗？？谢谢！
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厚德载物
10楼2010-07-09 21:46:27
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