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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】请教关于大肠杆菌lamda RED重组问题
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xmuwangym

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by zhangjingfei01 at 2010-04-12 14:04:47:
pkobeg质粒，比那个pKD46好一些。

您好！能麻烦您介绍一下那个质粒吗？
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厚德载物
11楼2010-07-09 21:47:21
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
★
hanjun80(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
Originally posted by xmuwangym at 2010-07-09 21:46:27:

您好！能麻烦您介绍一下这个质粒吗？？谢谢！

pKD46来源的一个质粒，有篇文献介绍过这个质粒的来源，具体是那篇还得查阅之后再告诉你，呵呵
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我有一个梦想，我梦想有一天，我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力，居住在自己愿意居住的地方。
12楼2010-07-10 19:21:43
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xmuwangym

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by zhaohq1209 at 2010-07-10 19:21:43:

pKD46来源的一个质粒，有篇文献介绍过这个质粒的来源，具体是那篇还得查阅之后再告诉你，呵呵

谢谢您哈，辛苦了~~
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厚德载物
13楼2010-07-19 21:34:01
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shenlin0514

木虫 (正式写手)

无名小虫
引用回帖:
Originally posted by xmuwangym at 2010-07-09 21:46:27:

您好！能麻烦您介绍一下这个质粒吗？？谢谢！

red同源重组中，常用的表达噬菌体重组酶的质粒是pastuer研究所的pKOBEG质粒，它含有araC启动子，培养条件是30度，建议制作含有该质粒的感受态时在OD600为0.2-0.3时进行L-ara诱导，0.6时制作电转感受态。
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Never say never
14楼2010-07-20 15:18:50
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创强

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
最近我也在做这个东西，但确实麻烦，很奇怪的是我做完电转化涂板后长出的少数几个单菌落，菌落PCR结果刚P出来时候是对的，在4°冰箱放了两天，跑电泳结果就变小 了，感觉是被降解了，但DNA这么稳定，怎么会被降解呢？？？
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15楼2010-08-08 20:27:31
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jimny22

金虫 (正式写手)
学习了！ 谢谢
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It is of no use crying over the spilt milk!
16楼2011-05-29 15:09:48
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鹏飞九万里

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
必须得电转。。。哪有文献说是化转。。。
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17楼2011-05-29 16:38:57
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yangbin1

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
这个问题我也遇到了主要解决方案：
1.缩短阿拉伯糖有到时间（1h足够，文献中给出的最小20min），诱导时间延长会使得自发突变的频率加大。
2.想办法用电转化，文献中一般都是用的电转化。
3.如果你缺失的这个基因对你这个菌本身很重要，缺失以后会致死，你也不能得到正确结果。
我现在在宿舍，关于相关文献你若需要明天可以到实验室后发给你，希望对你有帮助。
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18楼2011-05-29 23:28:56
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hanjun80

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by yangbin1 at 2011-05-29 23:28:56:
这个问题我也遇到了主要解决方案：
1.缩短阿拉伯糖有到时间（1h足够，文献中给出的最小20min），诱导时间延长会使得自发突变的频率加大。
2.想办法用电转化，文献中一般都是用的电转化。
3.如果你缺失的这个基 ...

多谢多谢，俺的RED重组已经上轨了
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我笃信:人定胜天！
19楼2011-05-30 07:32:12
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xiangquanju

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
19628095楼: Originally posted by gandalf886 at 2010-04-11 18:35:35:
1、用带有45bp同源臂的引物，PCR扩增卡那霉素或氯霉素基因；
同源臂可以延长。
2、用切胶回收的方法纯化PCR产物，100微升PCR产物最终浓缩为50微升；
你用什么酶P的，文献上说是taq加pfu，DpnI消化降解pKD3/4模 ...

鉴定引物就是同源臂的部分序列可以不呢，引物只要是敲除成功了，那么扩增出来的应该就是抗性基因片段的大小，而不是欲敲掉的基因的大小
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20楼2012-05-16 00:59:55
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