【求助/交流】请教关于大肠杆菌lamda RED重组问题 - 微生物 - 综合其他

厚德载物

11楼2010-07-09 21:47:21

zhaohq1209

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Originally posted by xmuwangym at 2010-07-09 21:46:27:

您好！能麻烦您介绍一下这个质粒吗？？谢谢！

pKD46来源的一个质粒，有篇文献介绍过这个质粒的来源，具体是那篇还得查阅之后再告诉你，呵呵

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我有一个梦想，我梦想有一天，我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力，居住在自己愿意居住的地方。

12楼2010-07-10 19:21:43

xmuwangym

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Originally posted by zhaohq1209 at 2010-07-10 19:21:43:

pKD46来源的一个质粒，有篇文献介绍过这个质粒的来源，具体是那篇还得查阅之后再告诉你，呵呵

谢谢您哈，辛苦了~~

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厚德载物

13楼2010-07-19 21:34:01

shenlin0514

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Originally posted by xmuwangym at 2010-07-09 21:46:27:

您好！能麻烦您介绍一下这个质粒吗？？谢谢！

red同源重组中，常用的表达噬菌体重组酶的质粒是pastuer研究所的pKOBEG质粒，它含有araC启动子，培养条件是30度，建议制作含有该质粒的感受态时在OD600为0.2-0.3时进行L-ara诱导，0.6时制作电转感受态。

Never say never

14楼2010-07-20 15:18:50

创强

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最近我也在做这个东西，但确实麻烦，很奇怪的是我做完电转化涂板后长出的少数几个单菌落，菌落PCR结果刚P出来时候是对的，在4°冰箱放了两天，跑电泳结果就变小了，感觉是被降解了，但DNA这么稳定，怎么会被降解呢？？？

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15楼2010-08-08 20:27:31

jimny22

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学习了！谢谢

It is of no use crying over the spilt milk!

16楼2011-05-29 15:09:48

鹏飞九万里

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必须得电转。。。哪有文献说是化转。。。

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17楼2011-05-29 16:38:57

yangbin1

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这个问题我也遇到了主要解决方案：
1.缩短阿拉伯糖有到时间（1h足够，文献中给出的最小20min），诱导时间延长会使得自发突变的频率加大。
2.想办法用电转化，文献中一般都是用的电转化。
3.如果你缺失的这个基因对你这个菌本身很重要，缺失以后会致死，你也不能得到正确结果。
我现在在宿舍，关于相关文献你若需要明天可以到实验室后发给你，希望对你有帮助。

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18楼2011-05-29 23:28:56

hanjun80

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引用回帖:

Originally posted by yangbin1 at 2011-05-29 23:28:56:
这个问题我也遇到了主要解决方案：
1.缩短阿拉伯糖有到时间（1h足够，文献中给出的最小20min），诱导时间延长会使得自发突变的频率加大。
2.想办法用电转化，文献中一般都是用的电转化。
3.如果你缺失的这个基 ...

多谢多谢，俺的RED重组已经上轨了

我笃信:人定胜天！

19楼2011-05-30 07:32:12

xiangquanju

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19628095楼: Originally posted by gandalf886 at 2010-04-11 18:35:35:
1、用带有45bp同源臂的引物，PCR扩增卡那霉素或氯霉素基因；
同源臂可以延长。
2、用切胶回收的方法纯化PCR产物，100微升PCR产物最终浓缩为50微升；
你用什么酶P的，文献上说是taq加pfu，DpnI消化降解pKD3/4模 ...

鉴定引物就是同源臂的部分序列可以不呢，引物只要是敲除成功了，那么扩增出来的应该就是抗性基因片段的大小，而不是欲敲掉的基因的大小

20楼2012-05-16 00:59:55