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hanjun80

金虫 (正式写手)

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[交流] 【求助/交流】请教关于大肠杆菌lamda RED重组问题已有17人参与

最近用lamda RED重组敲除大肠杆菌乳酸脱氢酶基因。可是一直出问题，分析不出来问题出在哪里，所以向各位大侠请教。以下是我的实验方法：

1、用带有45bp同源臂的引物，PCR扩增卡那霉素或氯霉素基因；
2、用切胶回收的方法纯化PCR产物，100微升PCR产物最终浓缩为50微升；
3、含有PKD46质粒的E. coli W1485菌株（K-12菌株变种）在LB中培养，OD＝0.2时加入L－Ara诱导酶们表达，OD在0.5左右用CaCl2制作感受态；
4、化学转化，而后涂卡那霉素（40ppm）平板；
5、一天后长出几十个菌落（据说RED重组效率很低，只能长出几个菌落来，偶为什么会长这么多？），每个菌落，接到两个平板上，其中一个带氨苄青霉素和卡那霉素抗性，另外一个只有卡那霉素抗性；挑出只在卡那霉素平板上生长的菌株，扩大培养（加了卡那霉素的液体LB培养基）；
6、扩大培养的菌提取基因组DNA（电泳的时候没有发现质粒的条带），用PCR扩增卡那霉素抗性基因，扩增不出来……

为什么出现6这个现象？做了好几组，总是不成功，菌种从W1485换成BL21也不行……
为什么会有这些假阳性？

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