| 查看: 4814 | 回复: 23 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
[交流]
【求助/交流】请教关于大肠杆菌lamda RED重组问题已有17人参与
|
|||
|
最近用lamda RED重组敲除大肠杆菌乳酸脱氢酶基因。可是一直出问题，分析不出来问题出在哪里，所以向各位大侠请教。以下是我的实验方法： 1、用带有45bp同源臂的引物，PCR扩增卡那霉素或氯霉素基因； 2、用切胶回收的方法纯化PCR产物，100微升PCR产物最终浓缩为50微升； 3、含有PKD46质粒的E. coli W1485菌株（K-12菌株变种）在LB中培养，OD＝0.2时加入L－Ara诱导酶们表达，OD在0.5左右用CaCl2制作感受态； 4、化学转化，而后涂卡那霉素（40ppm）平板； 5、一天后长出几十个菌落（据说RED重组效率很低，只能长出几个菌落来，偶为什么会长这么多？），每个菌落，接到两个平板上，其中一个带氨苄青霉素和卡那霉素抗性，另外一个只有卡那霉素抗性；挑出只在卡那霉素平板上生长的菌株，扩大培养（加了卡那霉素的液体LB培养基）； 6、扩大培养的菌提取基因组DNA（电泳的时候没有发现质粒的条带），用PCR扩增卡那霉素抗性基因，扩增不出来…… 为什么出现6这个现象？做了好几组，总是不成功，菌种从W1485换成BL21也不行…… 为什么会有这些假阳性？ |
回复此楼» 猜你喜欢
寻求一种能扛住强氧化性腐蚀性的容器密封件
已经有7人回复
-
到新单位后，换了新的研究方向，没有团队，持续积累2区以上论文，能申请到面上吗
已经有8人回复
-
申请2026年博士
已经有6人回复
-
请问哪里可以有青B申请的本子可以借鉴一下。
已经有5人回复
-
天津工业大学郑柳春团队欢迎化学化工、高分子化学或有机合成方向的博士生和硕士生加入
已经有5人回复
-
2025冷门绝学什么时候出结果
已经有7人回复
-
请问有评职称，把科研教学业绩算分排序的高校吗
已经有6人回复
-
Bioresource Technology期刊，第一次返修的时候被退回好几次了
已经有7人回复
-
请问下大家为什么这个铃木偶联几乎不反应呢
已经有5人回复
-
康复大学泰山学者周祺惠团队招收博士研究生
已经有6人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
大肠杆菌基因重组时PKD46高温怎么都消除不了
已经有25人回复- 大肠杆菌DH5a作感受态，PMD-19T载体连接重组的问题
已经有3人回复
- 大肠杆菌发酵问题
已经有28人回复
- 【求助/交流】关于测定大肠杆菌群密度度的 OD600 的问题
已经有15人回复
- 【求助/交流】重组质粒转化入大肠杆菌的问题
已经有6人回复
- 【求助/交流】关于大肠杆菌中蛋白表达的问题
已经有9人回复
yangbin1
金虫 (正式写手)
- 应助: 29 (小学生)
- 金币: 586.7
- 散金: 600
- 帖子: 343
- 在线: 94.6小时
- 虫号: 1303138
- 注册: 2011-05-22
- 专业: 病原细菌与放线菌生物学
18楼2011-05-29 23:28:56