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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】请教关于大肠杆菌lamda RED重组问题
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hanjun80

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】请教关于大肠杆菌lamda RED重组问题已有17人参与

最近用lamda RED重组敲除大肠杆菌乳酸脱氢酶基因。可是一直出问题，分析不出来问题出在哪里，所以向各位大侠请教。以下是我的实验方法：

1、用带有45bp同源臂的引物，PCR扩增卡那霉素或氯霉素基因；
2、用切胶回收的方法纯化PCR产物，100微升PCR产物最终浓缩为50微升；
3、含有PKD46质粒的E. coli W1485菌株（K-12菌株变种）在LB中培养，OD＝0.2时加入L－Ara诱导酶们表达，OD在0.5左右用CaCl2制作感受态；
4、化学转化，而后涂卡那霉素（40ppm）平板；
5、一天后长出几十个菌落（据说RED重组效率很低，只能长出几个菌落来，偶为什么会长这么多？），每个菌落，接到两个平板上，其中一个带氨苄青霉素和卡那霉素抗性，另外一个只有卡那霉素抗性；挑出只在卡那霉素平板上生长的菌株，扩大培养（加了卡那霉素的液体LB培养基）；
6、扩大培养的菌提取基因组DNA（电泳的时候没有发现质粒的条带），用PCR扩增卡那霉素抗性基因，扩增不出来……

为什么出现6这个现象？做了好几组，总是不成功，菌种从W1485换成BL21也不行……
为什么会有这些假阳性？
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我笃信:人定胜天！
1楼2010-04-11 13:44:29
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gandalf886

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
1949stone(金币+4): 2010-04-11 18:49
hanjun80(金币+3):多谢热心回复！ 2010-04-11 20:10
1、用带有45bp同源臂的引物，PCR扩增卡那霉素或氯霉素基因；
同源臂可以延长。
2、用切胶回收的方法纯化PCR产物，100微升PCR产物最终浓缩为50微升；
你用什么酶P的，文献上说是taq加pfu，DpnI消化降解pKD3/4模板。
3、含有PKD46质粒的E. coli W1485菌株（K-12菌株变种）在LB中培养，OD＝0.2时加入L－Ara诱导酶们表达，OD在0.5左右用CaCl2制作感受态；
ara浓度是多少，文献说在初始期即加入，1mM或10mM，这要看菌里有没有araBAD这几个基因，另外，一定是30度做感受态，一定是电转。
4、化学转化，而后涂卡那霉素（40ppm）平板；
40ppm是多少，文献是25ug/mL。
5、一天后长出几十个菌落（据说RED重组效率很低，只能长出几个菌落来，偶为什么会长这么多？），每个菌落，接到两个平板上，其中一个带氨苄青霉素和卡那霉素抗性，另外一个只有卡那霉素抗性；挑出只在卡那霉素平板上生长的菌株，扩大培养（加了卡那霉素的液体LB培养基）；
这一步没必要，可以先筛到重组子，再去消除pKD46
6、扩大培养的菌提取基因组DNA（电泳的时候没有发现质粒的条带），用PCR扩增卡那霉素抗性基因，扩增不出来……
不用提DNA，菌落PCR就够了，引物要设在同源臂两侧，而不是用抗性基因引物去P。
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3楼2010-04-11 18:35:35
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