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【求助/交流】请教关于大肠杆菌lamda RED重组问题已有17人参与
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最近用lamda RED重组敲除大肠杆菌乳酸脱氢酶基因。可是一直出问题，分析不出来问题出在哪里，所以向各位大侠请教。以下是我的实验方法： 1、用带有45bp同源臂的引物，PCR扩增卡那霉素或氯霉素基因； 2、用切胶回收的方法纯化PCR产物，100微升PCR产物最终浓缩为50微升； 3、含有PKD46质粒的E. coli W1485菌株（K-12菌株变种）在LB中培养，OD＝0.2时加入L－Ara诱导酶们表达，OD在0.5左右用CaCl2制作感受态； 4、化学转化，而后涂卡那霉素（40ppm）平板； 5、一天后长出几十个菌落（据说RED重组效率很低，只能长出几个菌落来，偶为什么会长这么多？），每个菌落，接到两个平板上，其中一个带氨苄青霉素和卡那霉素抗性，另外一个只有卡那霉素抗性；挑出只在卡那霉素平板上生长的菌株，扩大培养（加了卡那霉素的液体LB培养基）； 6、扩大培养的菌提取基因组DNA（电泳的时候没有发现质粒的条带），用PCR扩增卡那霉素抗性基因，扩增不出来…… 为什么出现6这个现象？做了好几组，总是不成功，菌种从W1485换成BL21也不行…… 为什么会有这些假阳性？ |
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yuanfeng
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hanjun80(金币+1):谢谢参与
hanjun80(金币+3):多谢仁兄建议 2010-04-12 13:11
lstt09nk(金币+3):感谢交流~~很热心~~ 2010-08-08 21:35:56
hanjun80(金币+1):谢谢参与
hanjun80(金币+3):多谢仁兄建议 2010-04-12 13:11
lstt09nk(金币+3):感谢交流~~很热心~~ 2010-08-08 21:35:56
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氯化钙转化恐怕是最大的问题吧。我没有看到文献上说用氯化钙方法转化DNA片段的，尽量联系下用电转吧。还有就是DNA片段的浓度和感受态细胞的浓度在做高些吧。DNA我们最后都是浓缩到500~1000ng/ul,电转时100ul的细胞加1ul片段。 1、我用的酶是fermentas的pfu酶；我没有用DpnI降解模版质粒；但事后我用碱裂法提取阳性克隆的质粒，并没有提出来； 这一步我们也不降解，pcr结束后切胶回收，纯化浓缩。 2、W1485的araBAD基因没有失活，所以我用的L－ara浓度是10mM； 这一步没什么为问题，可以一开始就加，也可以OD在0.1~0.2之间加，最后可以多养会，我们一般养到OD0.7左右。 3、因为实验室不具备电转条件，所以只能用化学转化； 这个化学转化恐怕不行吧 4、40ppm的卡纳霉素就是40ug/mL；但是我用的氯霉素是8ug/mL； 氯霉素太低了些 5、因为菌落PCR扩增不出来，所以才用基因组DNA扩增，但是我像上位仁兄的建议那样，我做了阴性和阳性对照实验了…… |
6楼2010-04-12 08:38:55