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回天堂的天使

新虫 (初入文坛)

[求助] 串联表达的问题

想请教各位高手一个问题。我有两个酶基因需要表达，由于两个基因在染色体上的位置是相邻的，A800bp左右，B为1.1kb左右，A在B的上游，中间只间隔了19bp，并且已经验证了它们处于同一个操纵子，因此考虑将两个基因一起扩增后接入pET-28a，16度表达过夜，电泳检测发现只表达了A基因，为包涵体表达。后来我在B基因前面又插入了一段T7启动子序列，同样条件表达，电泳检测就只表达了B基因。这两个基因我分别接入pET-28a表达的话，均能成功表达，只是A表达多数为包涵体，B为可溶表达。这个问题纠结了我很长时间了，不知道该怎么解释。。还望各位高手帮我分析分析。先拜谢了。
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1楼2011-11-16 20:43:03
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啊Q精神

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
silicare(金币+2): 谢谢参与 2011-11-17 12:15:33
A基因后面有核糖体识别位点吗？好像是SD序列吧。没有的话，B基因不会表达的。
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2楼2011-11-17 08:39:54
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sususimple

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
silicare(金币+5): 鼓励新虫发帖交流 2011-11-17 12:15:42
你可以用Novagen的Duet系列载体。
这类载体有两个多克隆位点。你把两个基因分别转入到相应的位点，就可以同时表达这两个蛋白了。
pETDuet-1 is designed for the coexpression of two target genes. The vector encodes two multiple cloning sites (MCS), each of which is preceded by a T7 promoter, lac operator and ribosome binding site (rbs).
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3楼2011-11-17 09:37:46
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回天堂的天使

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 啊Q精神 at 2011-11-17 08:39:54:
A基因后面有核糖体识别位点吗？好像是SD序列吧。没有的话，B基因不会表达的。

那为什么我在B前面插入了T7启动子以后就只表达B呢？A就不表达了呢？
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4楼2011-11-17 10:47:12
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回天堂的天使

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by sususimple at 2011-11-17 09:37:46:
你可以用Novagen的Duet系列载体。
这类载体有两个多克隆位点。你把两个基因分别转入到相应的位点，就可以同时表达这两个蛋白了。
pETDuet-1 is designed for the coexpression of two target genes. The vector ...

谢谢。不过这个系列的载体我们实验室没有。有哪位实验室有的愿意交换或者购买的么？
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5楼2011-11-17 10:52:57
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yixibiyu

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 回天堂的天使 at 2011-11-17 10:52:57:
谢谢。不过这个系列的载体我们实验室没有。有哪位实验室有的愿意交换或者购买的么？

我们实验室有pCDFDuet质粒，和pETDuet差不多，都是用来表达双基因的，你们有什么质粒，我们愿意交换
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6楼2011-11-17 12:16:00
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xinyaolu

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

能否附上质粒构建的详细图谱，这样可能更容易发现问题。串联表达在pET系统应该是可以实现的。
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7楼2011-11-17 18:15:50
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回天堂的天使

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by xinyaolu at 2011-11-17 18:15:50:
能否附上质粒构建的详细图谱，这样可能更容易发现问题。串联表达在pET系统应该是可以实现的。

A和B分别表达的质粒都是由NdeI和BamHI位点反向插入的，AB串联表达是用A的5‘引物和B的3’引物把AB及中间的19bp一起扩增，NdeI和BamHI反向接入。后来构建的插入了T7启动子的载体是设计引物从构建好的B的PET-28载体上将T7和B一起扩增，引物上引入HindIII位点，把构建好的A的PET-28质粒用HindIII酶切开，然后把T7+B片段接进去。具体步骤就是这样了。先多谢了。
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8楼2011-11-17 20:44:23
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xinyaolu

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

还是最好上图，如果两个基因前都带了RBS，B基因的RBS和A的终止密码子之间的距离太短可能会影响B的翻译
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9楼2011-11-17 21:11:51
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0624410024

金虫 (正式写手)

Begging for knowledge

【答案】应助回帖

楼主这种情况的话我觉得还是选择带有多克隆位点的载体进行构建比较保险！根据你的构建思路的话你还必须考虑到AB中间序列的影响等~~
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每天坚持多一点，以后困难少一点！
10楼2011-11-18 11:09:15
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