应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 串联表达的问题
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
141/2返回列表12下一页
查看: 2093  |  回复: 13
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

回天堂的天使

新虫 (初入文坛)

[求助] 串联表达的问题

想请教各位高手一个问题。我有两个酶基因需要表达，由于两个基因在染色体上的位置是相邻的，A800bp左右，B为1.1kb左右，A在B的上游，中间只间隔了19bp，并且已经验证了它们处于同一个操纵子，因此考虑将两个基因一起扩增后接入pET-28a，16度表达过夜，电泳检测发现只表达了A基因，为包涵体表达。后来我在B基因前面又插入了一段T7启动子序列，同样条件表达，电泳检测就只表达了B基因。这两个基因我分别接入pET-28a表达的话，均能成功表达，只是A表达多数为包涵体，B为可溶表达。这个问题纠结了我很长时间了，不知道该怎么解释。。还望各位高手帮我分析分析。先拜谢了。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2011-11-16 20:43:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

啊Q精神

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
silicare(金币+2): 谢谢参与 2011-11-17 12:15:33
A基因后面有核糖体识别位点吗？好像是SD序列吧。没有的话，B基因不会表达的。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2011-11-17 08:39:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sususimple

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
silicare(金币+5): 鼓励新虫发帖交流 2011-11-17 12:15:42
你可以用Novagen的Duet系列载体。
这类载体有两个多克隆位点。你把两个基因分别转入到相应的位点，就可以同时表达这两个蛋白了。
pETDuet-1 is designed for the coexpression of two target genes. The vector encodes two multiple cloning sites (MCS), each of which is preceded by a T7 promoter, lac operator and ribosome binding site (rbs).
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2011-11-17 09:37:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

回天堂的天使

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 啊Q精神 at 2011-11-17 08:39:54:
A基因后面有核糖体识别位点吗？好像是SD序列吧。没有的话，B基因不会表达的。

那为什么我在B前面插入了T7启动子以后就只表达B呢？A就不表达了呢？
赞一下 回复此楼
4楼2011-11-17 10:47:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

回天堂的天使

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by sususimple at 2011-11-17 09:37:46:
你可以用Novagen的Duet系列载体。
这类载体有两个多克隆位点。你把两个基因分别转入到相应的位点，就可以同时表达这两个蛋白了。
pETDuet-1 is designed for the coexpression of two target genes. The vector ...

谢谢。不过这个系列的载体我们实验室没有。有哪位实验室有的愿意交换或者购买的么？
赞一下 回复此楼
5楼2011-11-17 10:52:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yixibiyu

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 回天堂的天使 at 2011-11-17 10:52:57:
谢谢。不过这个系列的载体我们实验室没有。有哪位实验室有的愿意交换或者购买的么？

我们实验室有pCDFDuet质粒，和pETDuet差不多，都是用来表达双基因的，你们有什么质粒，我们愿意交换
赞一下 回复此楼
6楼2011-11-17 12:16:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xinyaolu

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

能否附上质粒构建的详细图谱，这样可能更容易发现问题。串联表达在pET系统应该是可以实现的。
赞一下 回复此楼
7楼2011-11-17 18:15:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

回天堂的天使

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by xinyaolu at 2011-11-17 18:15:50:
能否附上质粒构建的详细图谱，这样可能更容易发现问题。串联表达在pET系统应该是可以实现的。

A和B分别表达的质粒都是由NdeI和BamHI位点反向插入的，AB串联表达是用A的5‘引物和B的3’引物把AB及中间的19bp一起扩增，NdeI和BamHI反向接入。后来构建的插入了T7启动子的载体是设计引物从构建好的B的PET-28载体上将T7和B一起扩增，引物上引入HindIII位点，把构建好的A的PET-28质粒用HindIII酶切开，然后把T7+B片段接进去。具体步骤就是这样了。先多谢了。
赞一下 回复此楼
8楼2011-11-17 20:44:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xinyaolu

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

还是最好上图，如果两个基因前都带了RBS，B基因的RBS和A的终止密码子之间的距离太短可能会影响B的翻译
赞一下(1人) 回复此楼
9楼2011-11-17 21:11:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

0624410024

金虫 (正式写手)

Begging for knowledge

【答案】应助回帖

楼主这种情况的话我觉得还是选择带有多克隆位点的载体进行构建比较保险！根据你的构建思路的话你还必须考虑到AB中间序列的影响等~~
赞一下 回复此楼
每天坚持多一点，以后困难少一点！
10楼2011-11-18 11:09:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 回天堂的天使 的主题更新
141/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 本科生物信息学，总分362 求07 08调剂 +5 q小倩1210 2026-04-06 5/250 2026-04-07 17:56 by 橘咂！
[考研] 生物工程求调剂 +13 喜欢还是不甘心 2026-04-05 13/650 2026-04-07 16:55 by Ecowxq666！
[考研] 华南理工0703化学，总分336求调剂 +10 手机用户 2026-04-03 11/550 2026-04-06 22:20 by michael2011
[考研] 一志愿安徽某211 0703化学总分339求调剂 +7 晚风不晚 2026-04-04 7/350 2026-04-06 14:06 by houyaoxu
[考研] 一志愿 江南大学 085602 化工专硕 338分求调剂 +15 路痴小琪 2026-04-05 15/750 2026-04-06 09:27 by cql1109
[考研] 材料专硕322分 +10 哈哈哈吼吼吼哈 2026-04-04 10/500 2026-04-05 21:22 by 学员8dgXkO
[考研] 求调剂求调剂 +8 121. 2026-04-02 8/400 2026-04-05 20:15 by lys0704
[考研] 一志愿9材料学硕297已过六级求调剂推荐 +11 adaie 2026-04-04 12/600 2026-04-05 19:04 by 蓝云思雨
[考研] 328分调剂 +6 门men 2026-04-04 6/300 2026-04-05 13:40 by imissbao
[考研] 工科08专硕机械275求调剂 +3 AaAa7420 2026-04-02 3/150 2026-04-05 13:26 by jp9609
[考博] 申博 +7 IQwQl 2026-04-04 7/350 2026-04-04 23:32 by mumin1990
[考研] 290求调剂 +7 luoziheng 2026-04-04 7/350 2026-04-04 23:17 by lqwchd
[考研] 286求调剂 +3 草木不言 2026-04-04 3/150 2026-04-04 22:40 by lbsjt
[考研] 368求调剂 +5 今华习 2026-04-03 7/350 2026-04-04 18:47 by imissbao
[考研] 319求调剂 +4 星星不眨眼喽 2026-04-03 4/200 2026-04-04 16:25 by 中飞院空管学院�
[考研] 专硕085601求调剂 +7 suyifei 2026-04-03 8/400 2026-04-03 14:00 by 欣喜777
[考研] 生物学308分求调剂（一志愿华东师大） +6 相信必会光芒万� 2026-03-31 7/350 2026-04-02 23:16 by JourneyLucky
[考研] 土木304求调剂 +4 兔突突突， 2026-04-02 5/250 2026-04-02 21:16 by 兔突突突，
[考研] 一志愿山东大学，085600，344 +7 魏子per 2026-04-02 8/400 2026-04-02 21:12 by 百灵童888
[考研] 318求调剂 +3 笃行致远. 2026-03-31 4/200 2026-04-02 15:56 by Jaylen.
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭