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XUMIN6891

金虫 (初入文坛)

[求助] 请教一下连接与转化问题！

各位大侠你们好！我想请教一下一个问题，我现在做的是串联表达，我是先分别扩增两段长度一样的串联片段，并且串联片段的序列都是重复的，然后我在这两段串联片段设计一个相同的限制性内切酶，目的是通过这个酶把这两段串联的片段连接起来，这样的话，我串联的长度就延长了，我现在时扩增的两段片段也都扩出来了，两段片段的大小都是350bp左右，然后双酶切，第一段片段我用ECORI和Sal I双酶切，第二段我用Sal I和Xhol I双酶切，条带也都有，然后我把这两段双酶切回收的产物和PET-30a（+）载体双酶切【载体用ECORI，Xhol I双酶切回收】这三段我在一个体系里面连接，然后转化，但是最后我挑菌进行pcr鉴定扩出来的条带大小只有350bp多，按说连上应该是680bp多，双酶切鉴定也没有那条目的条带的条带，这样不是说我没连上吗，这样的话我应该怎样改进啊？请各位指导一下！谢谢！我以前做出来的一段串联片段也是按这种方法做的，测序也都正确！
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1楼 2011-12-11 09:17:45
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panda73

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+2): Good！ 2011-12-11 17:55:31
XUMIN6891(金币+2): 2011-12-22 08:51:27
如果你去测序，就会发现克隆到你的载体中的都是第一个片段（EcoRI+SalI)，原因很简单，salI和XhoI是同粘酶（酶切后产生的粘性末端一样）。改进方法很简单：将XhoI或者SalI合成其他合适的酶就行了
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2楼2011-12-11 10:11:22
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panda73

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

将XhoI或者SalI换成其他合适的酶就行了
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3楼2011-12-11 10:12:34
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j2

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by panda73 at 2011-12-11 10:11:22:
如果你去测序，就会发现克隆到你的载体中的都是第一个片段（EcoRI+SalI)，原因很简单，salI和XhoI是同粘酶（酶切后产生的粘性末端一样）。改进方法很简单：将XhoI或者SalI合成其他合适的酶就行了

请教一下，末端一样就不可能出现第1,2连接后于载体连接的情况么？还是只是这种几率太低，基本做不出来
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修炼ｉｎｇ，当虫仙……
4楼2011-12-11 16:22:39
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking(金币+2): 鼓励积极应助！ 2011-12-11 21:56:00
引用回帖:
2楼: Originally posted by panda73 at 2011-12-11 10:11:22:
如果你去测序，就会发现克隆到你的载体中的都是第一个片段（EcoRI+SalI)，原因很简单，salI和XhoI是同粘酶（酶切后产生的粘性末端一样）。改进方法很简单：将XhoI或者SalI合成其他合适的酶就行了

都忘了同粘酶的定义了，汗，赶紧搜了下：
同粘酶:
      识别不同的位点, 但产生相同的粘性末端。

刚看了下，Sal I和Xho I的位点最外面的一个碱基是不一样的啊，这两个就不算同粘酶了吧？
Xho I     C|TCGAG
            GAGCT|C

Sal I     G|TCGAC
           CAGCT|G
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5楼2011-12-11 18:14:53
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
5楼: Originally posted by 西瓜 at 2011-12-11 18:14:53:
都忘了同粘酶的定义了，汗，赶紧搜了下：
同粘酶:
      识别不同的位点, 但产生相同的粘性末端。

刚看了下，Sal I和Xho I的位点最外面的一个碱基是不一样的啊，这两个就不算同粘酶了吧？
Xho I     C|TCG ...

你要再多读几次定义.
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为什么
6楼2011-12-11 21:53:19
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 547star at 2011-12-11 21:53:19:
你要再多读几次定义.

Xho I的粘性末端是：TCGAG
Sal I 的粘性末端是： TCGAC
这两个不一样啊。请教啊。
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7楼2011-12-11 21:56:59
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547star

木虫 (著名写手)
★
西瓜(金币+1): Thanks 2011-12-12 18:30:21
我习惯叫同尾酶,粘末端都是TCGA呀.
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为什么
8楼2011-12-11 21:59:06
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cdl007

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+1): 原来如此。学些了！ 2011-12-12 18:30:39
TCGA的末端已经能够引发配对了
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9楼2011-12-12 13:56:08
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dnaxxx

至尊木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+3): Good！ 2011-12-13 18:27:20
也不一定要换酶，同尾酶会造成片段自连或者反向连接至第一个片段，但是还是有一定的概率可以正确连接的。
同尾酶产生的粘末端连上之后，用原来的酶是切不开的。可以用这个特性来进行鉴定。
建议你先把第一个片段连到载体上，然后zai连第二个吧，这样效率应该会高一些。
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10楼2011-12-13 07:52:13
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