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小米一粒m

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】大片段连接转化成功与否问题 已有6人参与

我的载体是pWL89a,电泳带大小5000bp多,单酶切切开后电泳带将近8000bp,目的片段4000bp左右,连接转化后有单菌落长出,挑菌培养后提质粒,质粒电泳后大小却略在4000bp左右,有可能插入后片段跑电泳的大小比原载体小吗?对引物进行特异性扩增扩出的目的条带大小正确,有可能是目的片段自连吗?请高手支招,谢谢
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小米一粒m

新虫 (初入文坛)

scelab:交流贴请勿纯表!自己的也不行 2010-07-27 23:44:24
2楼2010-07-27 19:32:10
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rosalie161

金虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
把质粒单酶切开,看能扩出你的目的条带不。
Rosalei.....
3楼2010-07-27 21:08:06
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sunyongle1

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
以前我也遇到类似的情况,PCR扩出来了,但是就是大小感觉不对。吓得我也没敢用。只好多挑了几个克隆,当时挑了十个,只有一个对的。
4楼2010-07-27 23:18:50
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小米一粒m

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by sunyongle1 at 2010-07-27 23:18:50:
以前我也遇到类似的情况,PCR扩出来了,但是就是大小感觉不对。吓得我也没敢用。只好多挑了几个克隆,当时挑了十个,只有一个对的。

你说最后挑出一个对的,那个成功的电泳大小是不是比环状载体大呢?其余九个是比环状载体小吗?PCR都能扩出目的条带是吧?
5楼2010-07-28 10:28:57
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小米一粒m

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by rosalie161 at 2010-07-27 21:08:06:
把质粒单酶切开,看能扩出你的目的条带不。

嗯,是个好办法,不确定的话就要这样检验了
6楼2010-07-28 10:30:17
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sunyongle1

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by 小米一粒m at 2010-07-28 10:28:57:
你说最后挑出一个对的,那个成功的电泳大小是不是比环状载体大呢?其余九个是比环状载体小吗?PCR都能扩出目的条带是吧?

至于是不是比环状载体大,我忘了。但是大小肯定是不对的。不过PCR都扩出来了。
7楼2010-07-28 12:29:07
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小米一粒m

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by sunyongle1 at 2010-07-28 12:29:07:

至于是不是比环状载体大,我忘了。但是大小肯定是不对的。不过PCR都扩出来了。

那你说的有一个对的,你是怎么判断是对的呢?测序吗?
8楼2010-07-28 13:24:21
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sunyongle1

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
直接酶切鉴定,看到酶切后有我的载体,和目的片段。而且大小都对。要是不切的话,大小等于载体和片段的和
9楼2010-07-28 13:34:11
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zgb1982

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by rosalie161 at 2010-07-27 21:08:06:
把质粒单酶切开,看能扩出你的目的条带不。

什么意思啊?我不太懂这样做有什么好处呢?
10楼2010-07-28 14:39:08
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