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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 动植物 » 综合其他 » 【求助/交流】大片段连接转化成功与否问题
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小米一粒m

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】大片段连接转化成功与否问题 已有6人参与

我的载体是pWL89a，电泳带大小5000bp多，单酶切切开后电泳带将近8000bp，目的片段4000bp左右，连接转化后有单菌落长出，挑菌培养后提质粒，质粒电泳后大小却略在4000bp左右，有可能插入后片段跑电泳的大小比原载体小吗？对引物进行特异性扩增扩出的目的条带大小正确，有可能是目的片段自连吗？请高手支招，谢谢
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1楼 2010-07-27 19:31:48
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小米一粒m

新虫 (初入文坛)
scelab:交流贴请勿纯表！自己的也不行 2010-07-27 23:44:24
2楼2010-07-27 19:32:10
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rosalie161

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
把质粒单酶切开，看能扩出你的目的条带不。
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Rosalei.....
3楼2010-07-27 21:08:06
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sunyongle1

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
以前我也遇到类似的情况，PCR扩出来了，但是就是大小感觉不对。吓得我也没敢用。只好多挑了几个克隆，当时挑了十个，只有一个对的。
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4楼2010-07-27 23:18:50
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小米一粒m

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by sunyongle1 at 2010-07-27 23:18:50:
以前我也遇到类似的情况，PCR扩出来了，但是就是大小感觉不对。吓得我也没敢用。只好多挑了几个克隆，当时挑了十个，只有一个对的。

你说最后挑出一个对的，那个成功的电泳大小是不是比环状载体大呢？其余九个是比环状载体小吗？PCR都能扩出目的条带是吧？
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5楼2010-07-28 10:28:57
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小米一粒m

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by rosalie161 at 2010-07-27 21:08:06:
把质粒单酶切开，看能扩出你的目的条带不。

嗯，是个好办法，不确定的话就要这样检验了
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6楼2010-07-28 10:30:17
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sunyongle1

木虫 (正式写手)
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
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Originally posted by 小米一粒m at 2010-07-28 10:28:57:
你说最后挑出一个对的，那个成功的电泳大小是不是比环状载体大呢？其余九个是比环状载体小吗？PCR都能扩出目的条带是吧？

至于是不是比环状载体大，我忘了。但是大小肯定是不对的。不过PCR都扩出来了。
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7楼2010-07-28 12:29:07
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小米一粒m

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by sunyongle1 at 2010-07-28 12:29:07:

至于是不是比环状载体大，我忘了。但是大小肯定是不对的。不过PCR都扩出来了。

那你说的有一个对的，你是怎么判断是对的呢？测序吗？
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8楼2010-07-28 13:24:21
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sunyongle1

木虫 (正式写手)
★
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直接酶切鉴定，看到酶切后有我的载体，和目的片段。而且大小都对。要是不切的话，大小等于载体和片段的和
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9楼2010-07-28 13:34:11
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zgb1982

木虫 (正式写手)
★
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引用回帖:
Originally posted by rosalie161 at 2010-07-27 21:08:06:
把质粒单酶切开，看能扩出你的目的条带不。

什么意思啊？我不太懂这样做有什么好处呢？
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10楼2010-07-28 14:39:08
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